交叉引物恒温扩增法诊断结核病的价值

2022-07-15 01:45高严
现代养生·上半月 2022年9期
关键词:回顾性分析

高严

【摘要】  目的  评价交叉引物恒温扩增法(crossing-primeramplification,CPA)检测技术诊断结核病的价值。方法  分析泾县医院2019年1月- 2021年6月进行CPA检测的207例疑似结核病住院患者的临床资料,并与罗氏培养检测、涂片改良抗酸染色镜检、结核抗体(tuberculosis antibody,TB-Ab)检测的实验结果相对比,评价各检测方法的诊断效能。结果  以罗氏培养为金标准,CPA检测的灵敏度和特异度分别为63.1%、95.1%,且和罗氏培养结果具有中高等程度的一致性(Kappa=0.626),诊断效能优于涂片改良抗酸染色镜检和结核抗体诊断技术。结论  CPA检测技术与罗氏培养的检测结果相似,但方法简便、快速,可用于疑似结核患者的快速诊断。

【关键词】  结核分枝杆菌;交叉引物恒温扩增;回顾性分析

中图分类号  R521    文献标识码  A    文章编号  1671-0223(2022)17--02

结核病是一种慢性传染病,由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起。2020年我国估计的结核病新患病人数为84.2万,估算的结核病发病率为59/10万,在结核病高负担国家中结核病新患病人数仅低于印度[1],结核病的防治依然严峻。为了能有效防治结核病,需要在疾病早期能够有一种检测技术可以快速地检测并诊断出MTB。传统的检测方法是从临床标本中(主要是痰液)经过抗酸染色或者培养来鉴定MTB,但它们各自都有优缺点。随着检测技术不断发展,MTB的分子学检测技术得到广泛的应用。交叉引物恒温扩增法(crossing-primeramplification,CPA)检测技术是其中一种快速分子诊断方法,它检测的是结核杆菌复合群特异性的IS16110序列。在恒温条件下,可以一次性进行基因片段的特异性扩增和杂交,然后在密闭的一次性核酸检测装置中使用免疫层析技术,定性检测特异性扩增产物,是中国自主创新的技术[2]。本研究采用对比方式,分析CPA对结核病的诊断价值。

1  对象与方法

1.1  研究对象

以泾县医院2019年1月- 2021年6月进行CPA检测的207例疑似结核病住院患者为研究对象。标本中痰液194例,胸腔积液11例,肺泡灌洗液1例,脓汁1例。本研究以罗氏培养法为金标准,共确诊65例结核病,其中男55例,女10例,年龄24~88岁;非结核患者142例,其中男111例,女31例,年龄18~86岁。

1.2  纳入排除标准

(1)纳入标准:咳嗽,咳痰>2周,痰中带血或咯血以及肺部影像学检测异常等肺结核疑似症状的患者。

(2)排除标准:正在进行规范化抗结核治疗且时间>2周的患者;经综合判断标准未能明确诊断或排除肺结核可能的患者。

1.3  检测方法

(1)CPA检测:采用杭州优思达的检测试剂盒(恒温扩增-试纸条法),标本需要经过液化、洗涤的手工步骤进行前处理,然后加入DNA提取液进行核酸提取,再将提取的核酸加入玻璃化试管中,恒温扩增1h,最后放入检测装置中读取结果。

(2)TB-Ab检测:采取胶体金法,吸取约100μl的血清或血浆加入试剂的样品孔中,15~20min判读结果。结果判断依据试剂说明书。

(3)涂片法:采用改良抗酸染色,标本的处理以及涂片染色步骤和结果判读按照《WS 288-2017肺结核诊断》附录B中的操作步骤进行。

(4)罗氏培养法:采用酸性改良罗氏固体斜面培养,痰液需要加入4%氢氧化钠进行前处理,然后按照参考文献进行标准化操作[3]。

1.4  统计学方法

数据统计分析采用SPSS 25.0统计软件。计数资料组间率的比較采用χ2检验。计算各检测方法的灵敏度、特异度与Kappa值。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  4种检测方法的阳性检出率比较

4种检测方法中,罗氏培养的阳性率最高,涂片法的阳性率最低,组间阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

2.2  以罗氏培养法为金标准各检测方法的诊断效能

以罗氏培养为金标准,CPA检测诊断的灵敏度最高,特异度略低于涂片法,并且与金标准诊断结果有较高的一致性,且高于其他两种方法,具有临床应用价值,见表2。

3  讨论

TB-Ab是对MTB的免疫学检测方法。TB-Ab检测操作简单,检测速度快,十几分钟可以报告检测结果。在本次研究中TB-Ab检测结核病的阳性率为25.1%,虽然和罗氏培养法的阳性率差异无统计学意义,但是TB-Ab阳性结果只能反映既往感染过MTB,且不能区分卡介苗接种导致的阳性,易造成假阳性。标本溶血或严重脂血也会对结果造成干扰,患者感染MTB早期,以及免疫功能低下或免疫缺陷又会导致结核抗体检测阴性,这是TB-Ab灵敏度低,以及和罗氏培养法结果一致性较差的原因。因此TB-Ab适合对疑似患者的筛查,其结果需结合其他检测结果综合判断。

罗氏培养法、涂片抗酸染色镜检是病原学检测手段。在本研究中罗氏培养的阳性检出率(31.4%)高于涂片抗酸染色(18.4%),有较好的阳性率,也是结核病诊断的金标准。但是由于结核杆菌在培养基上生成缓慢,约2~4周才能形成菌落,培养8周无菌落生长,才能报告阴性结果,这严重制约了结核病的早诊断早治疗。涂片抗酸染色镜检方便快捷,但其阳性率较低,阳性结果依赖于标本中细菌的含量,易造成漏诊,也不利于结核的诊断。

CPA检测是分子学检测手段,在本研究中CPA检测的阳性检出率为23.2%,略低于罗氏培养的阳性率31.4%。以罗氏培养为金标准时CPA检测的灵敏度为63.1%,特异度为95.1%,Kappa=0.626,两者检测结果具有中高程度的一致性,这与坦桑尼亚的一项研究结果相似[4],但灵敏度和一致性略低于姜晓颖等[5]的一项多中心研究。推测可能的原因在于CPA检测中核酸提取步骤需要手工操作多次,可能会造成核酸物质的损失,另外因为为回顾性研究,无法知道送检的痰液标本的质量,虽然医护人员会进行指导,但患者在自取痰液时执行度有待商榷。相比罗氏培养,CPA检测检测速度快,2h左右报告结果,其结果在密闭的装置中读取,可避免污染,减少假阳性产生[6]。在等待培养结果的过程中可用于快速鉴定MTB。此外有关文献报道,在肺外结核诊断中,以临床诊断为标准,CPA法在菌阳性结核患者中与罗氏培养法有较好一致性,在菌阴性结核患者中优于罗氏培养法[7],可见CPA检测也能很好地诊断肺外结核。CPA检测技术对结核有较好的检测效能。

綜上所述,CPA检测操作简便,不需要复杂的仪器,利于快速检测。对于疑似的结核患者,可使用TB-Ab对其进行结核病的初筛,再使用CPA检测等分子检测手段快速诊断,并与涂片镜检和培养比较,结合影像学和临床表现综合分析对结核病进行早诊断、早治疗。

4  参考文献

[1] Organization WH.Global tuberculosis report 2021[R].Geneva:World Health Organization,2021.

[2] 王烁程,张林波.结核病实验室检测技术研究进展[J].中国动物检疫,2020,37(3):78-85.

[3] 赵雁林,王黎霞,成诗明,等.分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册[M].北京:人民卫生出版社,2013:37-49.

[4] Mhimbira FA,Bholla M,Sasamalo M,et al.Detection of mycobacterium tuberculosis by EasyNAT diagnostic kit in sputum samples from Tanzania[J].J Clin Microbiol,2015,53(4):1342-1344.

[5] 姜晓颖,尹韶华,黄海荣,等.交叉引物扩增法对初诊肺结核患者检测效能的多中心研究[J].中国防痨杂志,2017,39(7):746-750.

[6] Xu G,Hu L,Zhong H,et al.Cross priming amplification: mechanism and optimization for isothermal DNA amplification[J].Sci Rep,2012,2:246.

[7] 毛秀军,葛晓励,高景利.交叉引物扩增技术在肺外结核早期诊断中的价值[J].中国生物制品学杂志,2016,29(6):637-640.

[2022-02-12收稿]

作者单位:242500  安徽省宣城市,泾县医院检验科

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