食品中亚硝酸盐测定发现的问题及其研究探讨

郝景雯，张宗煜,2,3,4,5，刘 然,2,3,4,5

(1. 天津市工业微生物研究所有限公司 天津 300462；2. 天津量信检验认证技术有限公司 天津 300462；3. 天津实发中科百奥工业生物技术有限公司 天津 300462；4. 天津市工业微生物企业重点实验室 天津 300462；5. 天津市工业微生物工程技术中心 天津300462)

0 引 言

亚硝酸盐是一类含氮无机化合物的总称，我们所说的亚硝酸盐一般指的是亚硝酸钠。亚硝酸钠为白色或淡黄色粉末，有时也呈颗粒状，易溶于水。食品生产中亚硝酸盐主要作为发色剂和防腐剂来使用。我国对食品中亚硝酸盐含量的最大使用量和最大残留限量进行了规定，并建立了多种检测亚硝酸盐的方法。测定亚硝酸盐的含量是食品安全检测中非常重要的项目。本文主要对 GB5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》的第二法分光光度法发生的实验现象进行了研究讨论。

1 食品中的亚硝酸盐

1.1 食品中亚硝酸盐的来源

食品中亚硝酸盐的来源，一是由于加工的需要而添加，二是施肥过度由土壤转移到植物源食物中。亚硝酸盐可以抑制梭状芽孢杆菌及形成的肉毒杆菌，以前常用作防腐剂，现已不常见。造成腌熏制品中亚硝酸盐含量较高的原因除直接添加外，还与植物源腌制品中硝酸盐在硝酸还原酶的作用下转化为亚硝酸盐有关。植物源食物原料沾染的部分微生物能分泌具有高活性的硝酸还原酶，影响硝酸还原酶活性的因素较多，包括食盐浓度、酸度、糖度、发酵温度、氧气含量、微生物污染等[1]。

1.2 硝酸盐、亚硝酸盐及N-亚硝基化合物的性质

硝酸盐在哺乳动物体内可转化成亚硝酸盐，亚硝酸盐可与胺类(脂肪族或芳香族仲胺，见图1)、氨基化合物及氨基酸等形成 N-亚硝基类化合物。亚硝酸盐既有氧化性，又有还原性，以氧化性为主[2-3]。

图1 亚硝酸盐在酸性条件与仲胺生成亚硝胺Fig.1 Formation of nitrosamines from nitrite and secondary amines in acid condition

1.3 硝酸盐、亚硝酸盐及N-亚硝基化合物的毒性

硝酸盐一般是低毒的，但亚硝酸盐及 N-亚硝基类化合物对哺乳动物有一定的毒性。对普通的兔、猪、鼠及怀孕的猪、羊进行食物中添加后的喂食试验结果显示硝酸盐对生殖能力影响的数据尚不能确定，在本质上没有基因毒性。亚硝酸盐虽有基因毒性，但对啮齿动物试验表明，连续2年大鼠按每天每千克体重摄入 6.7mg的亚硝酸根离子无副作用。亚硝酸盐能引起高铁血红蛋白的累积，当高铁血红蛋白超过10%时会产生毒性。N-亚硝基化合物有强烈的致癌性。亚硝酸盐摄入过多对人体造成的最初症状是头晕、头痛、视物不清、全身无力、反应迟钝，继而出现心悸、恶心、呕吐、腹痛等症状。

1.4 食品中的限量要求

GB 2762—2017对硝酸盐、亚硝酸盐及 N-亚硝基化合物在食品中的限量提出了要求。可能是由于三者的毒性差别较大，对硝酸盐、亚硝酸盐的限量都是 mg/kg(10-6，ppm)级，且对硝酸盐的限量比亚硝酸盐的限量高，对 N-二甲基亚硝胺的限量则是 μg/kg(10-9，ppb)级[4]。

2 实验讨论

2.1 实验现象的发现

本文主要对 GB5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》的第二法分光光度法发生的实验现象进行了研究讨论。根据GB5009.33—2016第二法测定亚硝酸盐，涉及到的反应原理是在盐酸溶液中对氨基苯磺酸和亚硝酸钠先反应生成重氮盐，再与盐酸萘乙二胺发生偶合反应，进而生成紫红色物质，在 538nm比色，用外标法确定含量[5]，见图 2、3。

图2 重氮盐的生成Fig.2 Formation of diazonium salt

由图 3可以看出该反应是芳香胺和重氮盐发生的偶合反应，产物中偶氮基团(—N＝N—)在萘环上的位置是根据萘环上的氨基定位规则推测出来的，但因实验室没有分离提纯及结构鉴定相关仪器设备，故无法确定是否正确。根据国标中的原理部分(GB5009.33—2016第 9部分)及有机化学反应相关理论，该反应需要在弱酸性溶液中进行。因为强酸性溶液会使萘环上的乙二胺基团变成铵盐，铵盐将使萘环的反应活性降低，而不能发生偶合反应。但在实验观察过程中，通过监控反应体系的 pH值，我们发现对氨基苯磺酸和亚硝酸钠生成重氮盐的反应体系呈强酸性，用pH试纸检测pH＝1～2，偶合后的反应体系仍然呈强酸性，用pH试纸检测pH＝1～2，这个现象与国标对反应原理的介绍和有机化学理论不相符。因此，实验过后我们对该反应体系进行了研究讨论。

图3 偶合反应Fig.3 Coupling reaction

2.2 调酸碱实验

将无色的重氮盐溶液和无色的盐酸萘乙二胺溶液混合在一起，生成了紫红色溶液，可以判断 2种溶液必然发生了反应，只是由于反应条件、国标中的原理和有机化学理论不相符，无法确定发生的是否为偶合反应。为了将反应体系调成弱酸性，我们向其中缓慢加入氢氧化钠溶液，在这个过程中，紫红色逐渐变浅，最终呈无色，此时已经呈强碱性。因不清楚在这个过程中是发生了其他反应，还是仅仅发生了“偶氮指示剂变色”现象，又向其中加入了过量的“20%盐酸(按照 GB 5009.33—2016中 10.2.8配制)”调至强酸性，紫红色再次出现，此时用 pH 试纸检测 pH＝1～2。我们对盐酸萘乙二胺溶液、对氨基苯磺酸溶液也进行了同样的调 pH试验，未发现变色现象，2种溶液始终保持无色。

2.3 试验结果分析

根据以上试验现象可以推测出，按照GB5009.33—2016操作，对氨基苯磺酸和亚硝酸钠先反应生成重氮盐，再与盐酸萘乙二胺混合，所发生的应该是偶合反应。原因之一是产物呈紫红色，在偶氮化合物中，芳香环通过偶氮基相连形成一大的共轭体系，π电子有较大的离域范围，可吸收可见光波长范围的光，因而显现颜色[6]。第二个原因是产物颜色随 pH而变化，该现象与部分偶氮化合物相同。如甲基橙即为偶氮化合物，它在酸碱溶液中结构发生变化而显示不同颜色，故被用作酸碱指示剂。由前述实验现象可以看出，该“指示剂”在碱性条件下无色，在酸性条件下呈紫红色。我们根据同样为偶氮指示剂的甲基橙的变色原理[7]推测了反应产物的变色原理，见图 4。

图4 可能的变色原理Fig.4 Possible discoloration principle

根据以上现象，我们进一步分析认为，该偶合反应能在强酸性条件下进行，反应条件、国标中的介绍和有机化学理论不相符，原因可能是盐酸没有和直接连在萘环上的仲胺(NH)成盐，而是和距离萘环比较远的伯胺(NH2)成盐，因此对萘环的反应活性几乎没有影响，见图5、图6。

图5 盐酸和仲胺成盐，萘环反应活性降低Fig.5 Decrease in reaction activity of naphthalene ring during salt formation using hydrochloric acid and secondary amine

图6 盐酸和伯胺成盐，萘环反应活性基本不变Fig.6 Unchanged reaction activity of naphthalenering during salt formation using hydrochloric acid and primary amine

3 讨论与展望

由于本试验未进行分离提纯及结构鉴定等实验步骤，无法验证GB 5009.33—2016的产物(即图3中的产物)结构是否正确，但可以进行推论：对氨基苯磺酸和亚硝酸钠生成重氮盐，再与盐酸萘乙二胺发生偶合反应，其产物是一种偶氮指示剂，而且未在目前化学试剂销售的相关网站上找到匹配的相应物质成品。后续应该将该产物进行分离提纯，并通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、X射线衍射等技术手段进行结构鉴定(包括但不限于以下 2方面：①产物是否为偶氮化合物；②如果产物是偶氮化合物，在萘环上的取代位置是否正确)，以确定其变色原理，也有可能使其发展成为一种新型的化学指示剂。

为进一步分析讨论，又查找了其他测定亚硝酸盐的检测标准，发现在 GB/T 5750.5—2006《生活饮用水标准检验方法 无机非金属指标》第 10部分[8]、GB/T 6912—2008《锅炉用水和冷却水分析方法 亚硝酸盐的测定》[9]、GB/T 7493—1987《水质 亚硝酸盐氮的测定 分光光度法》[10]、GB 8538—2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》第 41部分[11]这 4个标准中检测亚硝酸盐涉及的反应和GB 5009.33—2016相似，只是把对氨基苯磺酸(p-NH2-C6H4-SO3H)换成了对氨基苯磺酰胺(p-NH2-C6H4-SO2NH2)，如图7所示。因其偶合产物已经有商品销售 CAS 13231-94-2，故没有对这个反应进行实验。

图7 GB/T 5750.5—2006、GB/T 6912—2008、GB/T 7493—1987、GB 8538—2016的产物Fig.7 Products of GB/T 5750.5-2006，GB/T 6912-2008，GB/T 7493-1987 and GB 8538-2016

GB/T 5750.5—2006第5部分是检测硝酸盐，因5.4部分是先将硝酸盐还原成亚硝酸盐，再与对氨基苯磺酰胺、盐酸萘乙二胺反应，因而可以看作与前述4个标准涉及的反应一样。在这几个标准中，产物的颜色不完全相同。根据这几个标准描述的内容，我们发现其产物很可能也是指示剂，而且影响其颜色的因素很可能比较复杂，现把这5个部分中相关信息归纳如下。

①在GB/T 5750.5—2006第5.4部分中，对氨基苯磺酰胺的配制是将 5g对氨基苯磺酰胺溶于350mL(1+6)盐酸中，用水稀释至 500mL。盐酸萘乙二胺的配制是 0.5g盐酸萘乙二胺溶于 500mL水中。测定时先将 0.5mL对氨基苯磺酰胺溶液和样品(可能含有亚硝酸盐)及亚硝酸盐标准曲线混合均匀，反应2～8min后再加入0.5mL盐酸萘乙二胺溶液，产物呈玫瑰红色。在 5.4.5.3.3后面的注 1中也写明pH对显色有影响。

②在 GB/T 5750.5—2006第 10部分中，对氨基苯磺酰胺、盐酸萘乙二胺的配制和第 5.4部分一致，但测定时的用量不一样，先将 1mL对氨基苯磺酰胺溶液和样品(可能含有亚硝酸盐)及亚硝酸盐标准曲线混合均匀，反应2～8min后再加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，产物呈紫红色。

③在GB/T 6912—2008中，亚硝酸盐的标准贮备液是用水配制，对氨基苯磺酰胺、盐酸萘乙二胺的配制是将 40g对氨基苯磺酰胺溶于 100mL磷酸与500mL水的混合液中，再加入 2g盐酸萘乙二胺，用水定容至 1L，该混合液被称为显色剂，测定时将样品(可能含有亚硝酸盐)及亚硝酸盐标准曲线与显色剂混合均匀，反应20min后比色，产物呈粉红色。

④在GB/T 7493—1987中，亚硝酸盐的标准贮备溶液是用水配制，配好再加氯仿，显色剂的配制、亚硝酸盐标准曲线的梯度、测定过程与《GB/T 6912—2008》一样，产物呈红色。

⑤在GB 8538—2016第41部分中，对氨基苯磺酰胺、盐酸萘乙二胺的配制和亚硝酸盐测定过程与GB/T 5750.5—2006第10部分一样，而且这2个标准中亚硝酸盐标准储备液、标准使用液的浓度接近，标准曲线的梯度一样，产物呈紫红色。

根据上面的介绍由此推断，影响化合物 13231-94-2(即图7中化合物)溶液颜色的因素可能包括：①pH值；②对氨基苯磺酰胺、盐酸萘乙二胺的配制方式(单独配制、配成混合液)、配制溶剂(稀盐酸、稀磷酸)及反应时的用量(0.5mL、1mL)；③在亚硝酸盐标准贮备溶液的配制过程中是否加入了少量氯仿等，即化合物 13231-94-2所在体系的 pH、生成过程、体系中的离子、样品浓度、水溶液中是否有少量氯仿，这些因素都可能影响到溶液的颜色。