经典名方银翘散薄层鉴别标准提升研究

张会敏，宋健，徐林，董学，钟方晓*

(1.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；2.山东中医药大学，山东 济南 250355)

薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)操作简便、成本低、时间短、设备简单，是中药单味药及复方制剂质量控制的主要方法[1-4]，是中药质量标准的重要组成部分。目前，已上市中成药品种约有6万个批准文号，9 000多个质量标准。2020版《中国药典》中银翘散由金银花、连翘、桔梗、薄荷、竹叶、荆芥穗、淡豆豉、牛蒡子、芦根、生甘草10味中药组成，其薄层鉴别项下仅对金银花和连翘进行鉴别[5]，且连翘鉴别样品制备需要通过大孔吸附树脂柱，方法较繁琐。研究人员对银翘散袋泡茶[6]、银翘口服液[7]及其他剂型[8]进行了薄层色谱鉴别，共同存在的问题是对每一种药材进行鉴别时都需要单独建立一种供试品制备方法，每展开一块薄层板都需要不同的展开条件，耗时较长，有的操作较繁琐，且多采用价格昂贵的单一对照品进行鉴别。

系列薄层色谱法，也有学者称之为系统薄层色谱法或“整体鉴别”，是一种适用于分离、鉴别中药复方复杂体系中单味药的薄层色谱法[9-10]。首先，对同一份中药复方制剂，采用不同极性试剂(从小到大)进行系统提取/萃取处理，得到不同极性部位的样品供试品溶液，同法制备各单味药的阴性供试品溶液，甲醇提取制备各对照药材溶液；然后以对照药材或对照品为对照，根据供试品极性大小、分离度，考察一系列展开剂，确定适合每种单味药分离、鉴别的供试品溶液及展开剂；最后，每一块展开的薄层板分别按照可见光—紫外—喷显色剂—紫外—加热—可见光—紫外的顺序进行一系列观察，确定适合鉴别每种单味药的显色方法；最终建立适合中药复方中每一种单味药的薄层色谱鉴别方法。近十年来，在利用不同极性溶媒分步提取制成几种供试品溶液鉴别不同单味药、同一种供试品溶液或同一种展开条件同时鉴别多个处方药味、系列薄层色谱法鉴别单味药方面已有不少探索[5,11-15]，但是多集中于单味药或者小复方中几味药的鉴别，且未见采用系列薄层色谱法对银翘散及其成方制剂中10味药进行系统研究的报道。

本文利用系列薄层色谱法分别对银翘散的10种单味药进行鉴别探索，建立只制备一次供试品样品，尽量使用对照药材即可鉴别出银翘散中的多种单味药材的方法，为进一步完善提升《中国药典》中银翘散的质量标准提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

SB-5200DTS超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；BP211D型电子天平(德国Sartorius公司)；ZF-6型三用紫外线分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；精宏DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；贝尔德939薄层制版器(重庆市南岸贝尔德仪器技术厂)；HH-4数显恒温水浴锅(金坛市晶玻实验仪器厂)；薄层层析硅胶G(青岛海洋化工有限公司)；GF254薄层板20 cm×10 cm(烟台市化学工业研究所)；羧甲基纤维素钠300～8 000 mPa·s(国药集团化学试剂有限公司)；甲醇、石油醚、乙酸丁酯、乙醇、氨水、甲苯、甲酸等均为分析纯。

1.2 样品及对照药材

自制10批次银翘散(S1～S10)；金银花对照药材(121060-201608)、连翘对照药材(120908-201216)、薄荷对照药材(120916-201812)、甘草对照药材(120904-201620)、淡豆豉对照药材(121594-201804)、荆芥穗对照药材(121424-201505)、牛蒡子对照药材(120903-201811)均购自中国食品药品检定研究院。

2 方法及结果

2.1 供试品溶液制备

(1)步骤1

称取银翘散10.0 g，加甲醇30 mL超声30 min，放置室温，滤过，滤液加水10 mL，用石油醚(30～60 ℃)20 mL、乙酸乙酯5 mL混合溶剂萃取两次，萃取后的水液备步骤2用，合并有机溶液层；减压回收有机溶剂，残渣加甲醇溶解，定容至1 mL，作为供试品溶液(A)(用于鉴别连翘和薄荷)。

(2)步骤2

(3)步骤3

步骤2中下层溶液1与下层溶液2合并，蒸干，用甲醇溶解定容至1 mL，作为供试品溶液(C)(用于鉴定金银花)。

2.2 阴性对照溶液的制备

按银翘散处方组成，分别称取缺金银花、连翘、薄荷、牛蒡子、淡豆豉、荆芥穗、甘草的阴性样品，按照2.1项下银翘散供试品溶液制备方法制备各阴性对照溶液。

2.3 对照药材溶液的制备

取金银花、薄荷各0.50 g，连翘、牛蒡子、甘草、淡豆豉、荆芥穗对照药材各1.00 g，分别加甲醇2.0、2.0、1.5、1.5、1.5、1.5、2.0 mL浸泡过夜，分取上清液作为各对照药材溶液。

2.4 薄层色谱鉴别

2.4.1 金银花的鉴别

注：1—金银花阴性溶液；2—金银花对照药材；3～12—供试品溶液C。图1 金银花TLC鉴别Fig.1 Identification of Lonicerae Japonicae Flos using TLC

2.4.2 连翘的鉴别

注：1～5、8～12—供试品溶液A；6—连翘阴性溶液；7—连翘对照药材。图2 连翘TLC鉴别(可见光)Fig.2 Identification of Forsythiae Fructus using TLC (visible light)

2.4.3 薄荷的鉴别

注：1—薄荷阴性溶液；2—薄荷对照药材；3～12—供试品溶液A。图3 薄荷TLC鉴别(365 nm紫外光)Fig.3Identification of Menthae Haplocalycis herba using TLC (365 nm ultraviolet light)

2.4.4 牛蒡子、甘草共同鉴别

注：1～5、10～14—供试品溶液B；6—牛蒡子对照药材;7—牛蒡子阴性溶液;8—甘草阴性溶液;9—甘草对照药材。图4 甘草TLC鉴别Fig.4 Identification of Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma using TLC

注：1～5、10～14—供试品溶液B；6—牛蒡子对照药材；7—牛蒡子阴性溶液；8—甘草阴性溶液；9—甘草对照药材。图5 牛蒡子TLC鉴别(可见光)Fig.5 Identification of Arctii Fructus using TLC (visible light)

2.4.5 淡豆豉、荆芥穗共同鉴别

注：1～5、10～14—供试品溶液B；6—淡豆豉对照药材；7—淡豆豉阴性溶液；8—荆芥穗阴性溶液；9—荆芥穗对照药材。图6 淡豆豉TLC鉴别(254 nm紫外光)Fig.6 Identification of Sojae Semen Praeparatum using TLC (254 nm ultraviolet light)

注：1～5、10～14—供试品溶液B；6—淡豆豉对照药材； 7—淡豆豉阴性溶液；8—荆芥穗阴性溶液；9—荆芥穗对照药材。 图7 荆芥穗TLC鉴别Fig.7 Identification of Schizonepetae Spica using TLC

3 讨论

通过对银翘散各单味药材的系列薄层鉴别探索，发现芦根在各展开剂条件下斑点稀少，在紫外和可见光下，与银翘散各部分供试品溶液无对应斑点；淡竹叶中与银翘散供试品溶液有一对应斑点，但此成分不稳定，放置1 h后，此斑点消失；桔梗与银翘散供试品溶液有对应斑点，但阴性对照的干扰较大。因此在对银翘散进行薄层鉴别时，只保留了金银花、连翘、牛蒡子、薄荷、甘草、淡豆豉、荆芥穗等7味药材的鉴别方法。

本文采用系列薄层色谱法对银翘散样品进行系统提取，一次制备得到三个不同极性部位的供试品溶液，同法制备各单味药阴性对照溶液；所有对照药材溶液均采用甲醇浸泡过夜方法制备，操作非常简单。然后对不同极性部位的供试品、阴性对照、对照药材溶液进行展开，找出适合鉴别该药材的供试品溶液，建立该药材的薄层鉴别方法；并且实现了一块薄层板、一次展开即可分别对牛蒡子与甘草、淡豆豉与荆芥穗进行共同鉴别。而传统薄层鉴别中[6-8]，需要对中药复方制剂中每一味药材都建立一种供试品处理方法和一种展开条件，相比之下，本方法不仅节省了大量的供试品处理时间，且仅使用对照药材作为对照，节省了中药生产企业大量的检测成本，具有可操作性强、检测成本低、方法简单等优点。

本文建立的银翘散中金银花、连翘、牛蒡子、薄荷、甘草、淡豆豉、荆芥穗等7味药材定性鉴别方法，找到了各单味药的专属斑点，斑点对应一致、清晰，Rf值适中，且阴性无干扰。此方法简单快捷、重复性良好、可行性强，可以快速有效地鉴别银翘散中7味药材，为《中国药典》中银翘散薄层鉴别内容补充和质量标准提升提供了实验依据，也为其他银翘散成方制剂的TLC鉴别提供了参考。