基于网络药理学和分子对接探讨猫爪草治疗肺腺癌的作用机制

刘幸，黄红丽，张乐，刘向芳，张文林，沈凌筠

(昆明市第三人民医院 云南省传染性疾病临床医学中心，云南 昆明 650041)

目前肺腺癌是我国发病率和病死率最高的恶性肿瘤[1]，确诊为各期肺腺癌后能够存活10年的患者不到7%[2]，大约有四分之三的肺腺癌患者在确诊后已经失去了手术的机会[3]。过晚的诊断以及有效个体化治疗的缺失，需要我们更好地去了解治疗肺腺癌药物的作用机制，寻找有效靶向药物。猫爪草为毛茛科植物小毛茛RanunculusternatusThunb. 的干燥块根[4]，具有散结、解毒、消肿之功[5]，含有多种生物活性成分，具有良好的抗结核、抗肿瘤等作用[6]。网络药理学通过融合系统生物学、生物信息学和网络科学等学科，从系统层次和生物网络的整体角度出发，分析药物与治疗对象之间的分子关联，揭示药物的系统性药理机制[7]。本研究通过药物-疾病相互作用关系构建药物-靶点-疾病的多层次网络，寻找猫爪草治疗肺腺癌潜在的化学成分和作用靶点。利用网络药理学系统的研究方法，为猫爪草治疗肺腺癌的临床应用提供合理的科学依据。

1 材料与方法

1.1 猫爪草的活性成分筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集猫爪草的活性成分。设定TCMSP数据库中的ADME属性，以口服利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug-likeness，DL)作为筛选条件，其中OB≥30%、DL≥0.18[8]。

1.2 猫爪草活性成分的靶点预测

从TCMSP数据库中提取猫爪草活性成分的靶点信息，利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)对靶点信息进行注释，筛选条件为“reviewed”，物种限定为人类。

1.3 肺腺癌相关基因的筛选

分别从GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和OMIM数据库(https://omim.org)中以“adenocarcinoma”为关键词，挖掘治疗肺腺癌的潜在靶点。删除重复的疾病靶点及与疾病相关性评分较低的靶点(relevance score>4)，将两个数据库获得的疾病靶点与猫爪草活性成分的靶点生成维恩图。

1.4 药物-成分-靶基因-疾病的网络构建

去除猫爪草中无对应抗肺腺癌靶点的活性成分，将疾病、药物、活性成分、靶点作为网络图中的节点，运用Cytoscape_v3.8.2软件构建猫爪草活性成分-抗肺腺癌作用调控网络及可视化。节点之间的连接代表生物分子间的相互作用。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与分析

将猫爪草活性成分靶点与疾病靶点的交集靶点基因复制到STRING数据库(https://string-db.org/)中分析，将物种设置为“Homo Sapiens”，在设置中点击“hide disconnected nodes in the network”，更新去除离散的点，导出蛋白质-蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction，PPI)的TSV文件，利用R软件的count包对文件进行分析，筛选核心基因。

1.6 分子对接验证

在PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中查询核心基因的3D结构，使用AutoDockTools对靶点蛋白进行加氢、去水等处理，并对靶点蛋白和活性成分进行对接验证，以亲和能作为分子对接的结果。亲和能<0代表靶点蛋白和活性成分能够自发结合，亲和能力强[9]。

1.7 核心基因在肿瘤组织中的表达

通过肿瘤免疫评估资源(tumor immune estimation resource, TIMER)数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中Diff Exp分析模块，检索与猫爪草活性成分结合能力最强的核心基因在肿瘤组织和正常组织中的表达差异。

1.8 GO与KEGG富集分析

通过UniProt数据库对猫爪草抗肺腺癌靶点进行注释，利用R软件的ClusterProfilerba包和Pathway包进行基因本体(gene ontology,GO)功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)信号通路分析，限定物种为人类，以P<0.05表示具有显著的富集作用，P值越小，富集程度越高。

2 结果

2.1 猫爪草的活性成分筛选

在TCMSP数据库中，以OB≥30%且DL≥0.18为筛选条件，得到猫爪草的活性成分12个，作用靶点496个。其中有2个活性成分无对应靶点，故将其删除，结果见表1。

表1 猫爪草活性成分Table 1 Active ingredients of Ranunculi Ternati Radix

2.2 猫爪草活性成分-抗肺腺癌靶点预测

从TCMSP数据库中提取猫爪草的全部作用靶点基因，共计40个，见表2。在GeneCards数据库和OMIM数据库中检索“adenocarcinoma ”，删除重复的疾病靶点及与肺腺癌相关性评分低的靶点(relevance score>4)，共得到6 654个肺腺癌的靶点基因。将猫爪草的40个靶点基因和肺腺癌的6 654个靶点基因利用R软件绘制维恩图，获得共同的交集靶点36个(图1)，分别为CHRM1、SCN5A、SLC6A2、ADRA1B、SLC6A3、ADRB2、PGR、NR3C2、PTGS1、PTGS2、NCOA2、KCNH2、CHRM3、ADRA1A、CHRM2、SLC6A4、OPRM1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、MAP2、ADH1C、RXRA、NCOA1、ADRA2A、AKR1B1、PLAU、LTA4H、MAOB、MAOA、ADRB1。

表2 猫爪草的作用靶点Table 2 Targets of Ranunculi Ternati Radix

注：蓝色代表肺腺癌靶点；黄色代表猫爪草靶点。图1 肺腺癌-猫爪草交集靶点Fig.1 Intersection target of Ranunculi Ternati Radix in lung adenocarcinoma

2.3 药物-成分-靶基因-疾病网络构建

通过Cytoscape_v3.8.2软件将猫爪草的10个活性成分与抗肺腺癌的36个作用靶点相连接，构建药物-成分-靶基因-疾病网络图(图2)。黄色椭圆形代表活性成分，紫色平行四边形代表肺腺癌，红色平行四边形代表猫爪草，蓝色三角形代表交集靶点。此图由48个节点、170条边构成，其中包含10个活性成分节点、36个作用靶点，充分体现猫爪草多成分、多靶点治疗肺腺癌的作用特点。

图2 猫爪草有效成分-靶点网络图Fig.2 Network diagram of active ingredients and targets of Ranunculi Ternati Radix

2.4 PPI网络构建与分析

将36个交集靶点复制到STRING数据库，去除离散点，获得PPI网络图(图3)。包含36个节点，108条边。图中节点表示靶点，螺旋结构表示该基因的三维结构，边表示靶点间的互作关系。使用R软件对图3中的连接点进行计数，得到靶点基因的count(节点计数)值，见表3。count值代表与此基因连接的节点数，数值越大表明在网络中与该靶点基因互作的靶点基因越多。count值最高的4个靶点基因分别为ADRA1B、CASP3、JUN、MAOA。

图3 PPI 网络图Fig.3 PPI network diagram

表3 靶点基因count值Table 3 Count value of target genes

2.5 分子对接验证

将count值最高的4个靶点基因与与猫爪草的10个活性成分分别进行分子对接，对接的亲和能值见表4。由表4可知，豆甾醇与ADRA1B、CASP3、MAOA的亲和能值均最低，结合能力均较强；β-谷甾醇与JUN的亲和能值最低，结合能力最强。结果表明，猫爪草的活性成分均可以对核心靶点基因发挥调控作用。选取CASP3结合能力最强的配体豆甾醇作图，见图4。

表4 靶点基因与活性成分亲和能量表Table 4 Affinity energy between the target genes and active ingredients

图4 CASP3与豆甾醇分子对接Fig.4 Molecular docking of CASP3 with stigmasterol

2.6 核心基因在肿瘤组织中的表达

如表4所示，count值最高的4个靶点基因中，平均亲和能值最低的基因为CASP3，以CASP3作为核心基因在TIMER数据库中检索其表达情况，数据库提供的33种肿瘤数据中，肺腺癌组织中CASP3 mRNA表达水平显著高于正常组织(P<0.001)，还有14种肿瘤组织中KIF11 mRNA表达水平均高于正常组织(P<0.01)，分别为：膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、胆管癌、结肠癌、食管癌、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、肝细胞肝癌、肺鳞癌、直肠腺癌、胃腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌，如图5所示。

注：*为<0.05；**为<0.01；***为<0.001。TPM(transcripts per million)为每百万转录本。图5 肿瘤组织中CASP3 mRNA的表达Fig.5 Expression of CASP3 mRNA in the tumor tissue

2.7 基因功能与信号通路分析

2.7.1 GO功能富集分析

将36个交集靶点进行GO功能富集分析，获得67条GO条目，校正P值(P<0.05)，取位于前20位的GO条目进行分析，并进行可视化展示(图6)。结果表明，这些靶点主要与G蛋白偶联胺受体活性、蛋白质异源二聚体活性、G蛋白偶联的神经递质受体活性、突触后神经递质受体活性、神经递质受体活性等生物过程有关。

图6 GO分析图Fig.6 GO analysis chart

2.7.2 KEGG信号通路分析

将获得的36个交集靶点进行KEGG信号通路富集分析，获得68条信号通路，校正P值(P<0.05)，取位于前20位的信号通路进行分析，并进行可视化展示(图7)。结果显示，猫爪草抗肺腺癌机制主要涉及神经变性的途径-多种疾病、神经活性配体-受体相互作用、脂质和动脉粥样硬化、钙信号传导途径、血清素神经突触、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导等通路，提示猫爪草抗肺腺癌可以通过多条信号通路发挥作用。

图7 KEGG信号通路Fig.7 KEGG signaling pathway

3 讨论

对猫爪草的药理研究发现，其多糖、皂苷、醇、酯和脂肪酸具有重要的抗肿瘤作用[10]。其中猫爪草活性成分总皂苷(total saponins，TSRT)可通过下调semaphorin 4D(Sema4D)的表达，抑制人非小细胞肺腺癌(NSCLC)A549的增殖[11]。对猫爪草多糖的研究也证明，200 μg/mL猫爪草多糖可显著提高巨噬细胞ANA-1细胞的增殖能力，其升高白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的表达，显示出较强的抗肿瘤作用[12]。上述研究表明，猫爪草及其有效成分具有显著的抗肿瘤作用。

本研究筛选出猫爪草10个与肺腺癌相关的活性成分及其36个作用靶点，并对其进行GO功能分析和KEGG信号通路富集分析，发现猫爪草在治疗乙型肝炎、糖尿病、肿瘤、神经系统疾病以及麻疹等多个方面都具有一定的药理作用。

通过GO功能富集结果可以看出，评分较高的基因功能是G蛋白偶联胺受体活性。G蛋白偶联受体(GPCRs)是7种跨膜结构域受体，可启动各种细胞反应并调节体内平衡[13]。GPCRs在多种肿瘤组织中高表达，积极参与肿瘤干细胞(CSCs)相关的信号传导和功能，GPCR拮抗剂和单克隆抗体可用于损害CSCs功能，抑制肿瘤细胞的生长[14]。 同时富集结果还显示，猫爪草活性成分参与了多种神经递质受体活性及其他重要的生物学功能(如细胞凋亡)。肿瘤细胞表面存在多种类型的神经递质受体[15]，研究表明这些神经递质受体参与调控多种肿瘤细胞的发生发展过程[16]，可影响多种肿瘤的进程。

分析KEGG信号通路富集结果，有多条癌症相关通路，例如小细胞肺腺癌、神经变性的途径-多种疾病、细胞凋亡等。其中包含CHRM1、PTGS2、CHRM3、BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8等多个靶点。这些靶点主要对应猫爪草植物甾醇类的2个活性成分β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)。实验证明小鼠的肿瘤组织细胞在β-谷甾醇组中产生了坏死区域，且出现明显的细胞凋亡。可看出β-谷甾醇具有抗肿瘤作用，作用机制可能和β-谷甾醇对血清中IL-6、IFN-γ和VEGF表达的调控相关[17]。通过MTT法和集落形成实验观察到豆甾醇能抑制胃癌细胞的生长，DAPI和annexin V/PI染色法显示出豆甾醇的抗增殖作用是由于其诱导线粒体介导的细胞凋亡。BAX和BCL2的表达进一步证实了这一点[18]。这些研究表明猫爪草中的植物甾醇可能是其抗肿瘤的主要活性成分。

在本研究中显示，肺腺癌组织中CASP3 mRNA表达水平显著高于正常组织(P<0.001)。CASP3靶点基因的亚致死激活作用，在原癌基因诱导的基因组不稳定和致癌转化中起着至关重要的促进作用[19]，CASP3靶点基因的多态性可能导致不良的细胞凋亡信号传导，从而促进多种人类癌症的发作，非小细胞肺腺癌的发生和发展或与CASP3靶点基因的多态性有关[20]。以上研究均为网络药理学的富集分析结果提供了科学的解释。

我们通过对KEGG信号通路富集结果的探讨，初步阐释了猫爪草治疗肺腺癌的作用机制，为进一步的实验研究奠定了基础，并为中药猫爪草的开发和应用指明了方向。