基于网络药理学探讨金荞麦抗呼吸道合胞病毒作用机制

杜海涛，王平，李娜，韩莉，丁洁，胡亚楠

(1. 山东省中医药研究院，山东 济南 250014； 2. 山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；3.天津大学 精密测试技术及仪器国家重点实验室，天津 300072)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染的主要原因，每年致55 000至199 000例儿童死亡[1-2]。由于感染后不会形成特异性免疫，患者愈后有再次感染的风险[3-4]。目前尚无特异性药物，疫苗研发进程缓慢[5]。中药在预防和治疗病毒感染性疾病方面有着悠久历史和丰富经验，通过作用于多层次的免疫功能，恢复机体环境的稳定与平衡，在体内外治疗中均表现出独特优势，开发应用前景广阔。

金荞麦为蓼科植物Fagopyrumdibotrys(D.Don) Hara的干燥根茎，又称野荞麦、金锁银开、赤地利等，归肺经，有清热解毒之功效，主治肺热咳喘、肺痈、咽喉肿痛等[6]。现代药理学研究表明，金荞麦根茎中含有多种化合物，包括黄酮类、萜类、甾体及鞣质等，多具有抗病毒、抗炎以及增强免疫等作用，但尚未阐明其药理作用机制[7-8]。

网络药理学融合生物信息学、系统生物学及网络分析等方法，探索生物实体之间潜在的作用关系[9-10]，其整体思路与中医药整体观念相一致，可以应用于解决中药多成分、多靶点、协同作用等特点带来的研究难题[11-12]。本研究在分子网络调控的层面对金荞麦主要药效成分进行计算机虚拟筛选，探索中药金荞麦抗RSV的整体作用机制，以期初步揭示金荞麦治疗RSV肺炎的药效基础，为更好地开发抗病毒药物提供参考依据。

1 方法

1.1 数据来源

本研究中采用的数据库和分析软件如下： TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；Open Babel (http://openbabel.org/wiki/Main_Page)；SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)；GeneCards (http://www.genecards.org/)； PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)；GenCLiP 3 (http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php)；NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；UniProt (http://www.uniprot.org/)； DAVID 6.8 (https://david.ncifcrf.gov/)； KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)；STRING (https://string-db.org/)；Cytoscape 3.7.1 (https://cytoscape.org/)； GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)；R Studio (https://rstudio.com/)；RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)；PyMol 2.3.0(https://pymol.org/)； AutoDock Tools 1.5.6(http://mgltools.scripps.edu/)； Vina(http://vina.scripps.edu/)； Python 3.7(https://www.python.org/)。

1.2 金荞麦化学成分的获取及靶点预测

中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)是一个用于中药的系统级药理学数据库，收纳了药典499种中草药的化学成分、ADME参数等信息[13]。以“金荞麦”为关键字，获取TCMSP数据库中该项下所有成分数据，根据引文方法对其靶点进行进一步活性成分筛选[14]。将收集的化学成分逐一传至Open Babel，将化合物结构转化为SMILES并导入到SwissTargetPrediction数据库，将化合物与数据库中靶点进行模拟对接，选取结果Probability>0的靶点[15]。

1.3 金荞麦作用靶点预测及RSV相关疾病靶点检索分析

以“Respiratory Syncytial Virus”作为关键词，通过GeneCards数据库查找和GenCLiP 3、NCBI文献检索，获取RSV感染后关联靶点，删除重复值建立RSV疾病靶点数据库。将化合物成分及靶点导入Cytoscape 3.7.1进行可视化，生成金荞麦抗RSV成分-靶点网络图，使用Network analyzer 插件分析网络特征靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用及KEGG通路富集分析

使用STRING平台获取靶标蛋白质-蛋白质相互作用( protein-protein interaction，PPI)关系[16]。将金荞麦抗RSV潜在靶点蛋白名输入设置隐藏无关联靶点，构建PPI网络导入Cytoscape 3.7.1，用Network analyzer 插件分析网络特征靶点[17]，以节点度值(degree)评价节点的重要程度[18]。将网络中大于2倍平均度值的节点定义为金荞麦抗RSV的核心靶点[19]。

将RSV疾病靶点基因名用UniProt数据库转换为Uniprot ID。在DAVID 6.8平台对金荞麦抗RSV核心靶点可能KEGG通路进行富集分析，选择差异性具有统计学意义(P<0.01)的条目，得到关键核心靶标参与的通路信息。将核心蛋白UniProt ID 输入KEGG平台，得到每条通路的信息图，整合后绘制金荞麦核心靶点信号通路图。

1.5 GEO芯片数据分析核心靶点

从GEO数据库检索并下载编号为GSE32138的芯片数据原始文件，该芯片收集了人气道上皮细胞对RSV感染的反应，包含4例经RSV感染2 h后模型组和4例对照组细胞的测序信息[20]。使用Benjamini&Hochberg算法对P值进行校正并筛选的差异基因[21]。使用R Studio将数据进行可视化，使用差异表达基因数据绘制火山图，筛选得到的核心靶点绘制热图。

1.6 分子对接

为了进一步验证筛选出的活性成分及核心靶点，将1.4项下金荞麦核心靶点信号通路图中的关键化合物与核心作用靶点及RSV结构靶点进行分子对接。从PBD数据库下载靶蛋白的高分辨三维晶体结构，使用PyMol 2.3.0 和Autodock Tools 1.5.6 进行分子前处理，保存为*.pdbqt格式文件。运行Python及Autodock Vina 进行批量半柔性分子对接，小分子输出结果用PyMol2.3.0软件可视化。

2 结果

2.1 金荞麦活性成分及靶点预测结果

通过TCMSP数据库检索出金荞麦的相关成分61个，经参数筛选出金荞麦中15个潜在活性成分(表1)。通过 SwissTargetPrediction 数据库获得上述活性成分作用靶点209个；在平台共检索到RSV肺炎表型相关靶点共845个，整理合并得到金荞麦体内抗RSV潜在相互作用靶点45个。

表1 金荞麦潜在活性成分Table 1 Potential active ingredients of Fagopyri Dibotryis Rhizoma

2.2 构建化合物-靶点网络

将筛选出的与RSV肺炎相关的靶点与成分建立关联，导入Cytoscap3.7.1 中，合并成金荞麦抗RSV成分-靶点相互作用关系，见图1。该关系有205个节点，911条边，可以看出同一靶点可对应不同活性成分，不同活性成分也对应多个靶点，充分体现了金荞麦多成分、多靶点的作用特点。

图1 金荞麦抗RSV成分-靶点网络图Fig.1 Anti-RSV ingredient-target network diagram of Fagopyri Dibotryis Rhizoma

2.3 PPI及KEGG通路富集分析结果

金荞麦抗RSV的核心靶点PPI网络见图2，该网络有35个节点，97条边，平均度值为5.543，大于2倍度值的AKT1、VEGFA、PTGS2、SRC、EGFR是该网络的核心节点。对金荞麦15个化合物预测的靶点使用DAVID 6.8进行KEGG通路富集分析(P<0.01)。富集得到金荞麦抗RSV的30条主要通路，选取涉及抗病毒免疫的前6条通路将其结果可视化，可见金荞麦抗病毒主要涉及VEGF信号通路、Rap1信号通路、PI3K-Akt信号通路等，指示金荞麦可能通过这些通路发挥抗RSV作用，如图3 所示。

注：代表靶点度值由低到高。图2 金荞麦抗RSV的PPI网络 Fig.2 PPI network of Fagopyri Dibotryis Rhizoma against RSV

图3 KEGG通路富集分析结果Fig.3 Results of KEGG pathway enrichment analysis

将图3的6条金荞麦抗RSV相关通路进行整合绘制主要靶点信号通路图，由金荞麦直接作用的靶点标记为红色(图4)。提示金荞麦抗RSV靶点主要分散于这几条通路中，通过调节其中的几个关键靶点发挥作用，且多数靶点在多条通路中发挥作用，如VEGF、AKT等。在核心靶点中未出现的BCL2、STAT3和KDR也有多条通路涉及，可能在通路间起调控枢纽的作用。将2.3项下得到的核心成分及涉及的靶点、通路汇总得到核心成分-基因靶点-信号通路图(图5)，该网络有24个节点、73条边。从网络中可以看出，金荞麦多个有效成分能够作用于多个靶点，这些靶点进一步调节核心信号通路，体现了金荞麦多成分、多靶点整体调节的抗病毒作用机理。

图4 核心靶点信号通路关联图Fig.4 Correlation diagram of core target signaling pathway

图5 核心成分-靶点-信号通路图Fig.5 Core ingredient-target-signaling pathway diagram

图6 RSV感染相关芯片差异表达基因火山图及差异表达基因的聚类热图Fig.6 Volcanic mapand cluster heatmap of differentially expressed genes related to RSV infection

2.4 候选靶点分析

对GEO芯片数据库基因芯片的二次分析筛选获得差异表达基因17 720个，筛选条件：P<0.01且Fold Change的绝对值>2，从结果中发现金荞麦抗RSV核心靶点全部属于有意义的差异表达基因。以芯片中各个核心靶点上下调表达情况绘制聚类热图，使用绿色代表下调基因，红色代表上调基因，可以看出对照组和模型组在各自的组内能够聚到一起，两组之间具有明显差异，该结果间接验证了筛选出核心靶点的有效性。

2.5 分子对接

从RCSB PDB数据库中共获取了11个靶点蛋白，分别为RSV-G(6BLH)、RSV-F(5UDE)、RSV-L&P(6PZK)、SRC(2H8H)、PTGS2(5F19)、AKT1(1UNQ)、VEGFA(4ZFF)、EGFR(5WB7)、STAT1(3WWT)、KDR(3S35)与BCL2(5VAU)，其详细信息见OSID。分子对接配体受体之间对接的结合能越低，发生作用的可能性就越大，以结合能≤-20.93 kJ/mol作为判定标准，小于此值说明配体具有潜在调节受体的活性。金荞麦与靶点间的对接结合能见图7，可以看出多数化合物与各靶点结合能达到标准，原花青素B1(MOL000004)，β-谷甾醇(MOL000358)等与各靶点间结合能总和绝对值较高，初步验证了网络药理学预测结果的可靠性。图8列出了前4位核心成分与靶蛋白的结合位置(A1-H1)与3D对接细节(B2-H2)。分子对接结果说明金荞麦核心成分可能主要依靠直接抑制病毒RNA的复制、转录从而抑制病毒在体内的复制增殖(RSV-L&P)，控制免疫进程、细胞周期、凋亡、迁移(SRC)等过程发挥抗RSV作用。

注：单位kJ/mol。图7 核心成分与靶点间的结合能热图Fig.7 Binding energy heatmap of core ingredients and targets

注：A为原花青素B1与RSV L&P蛋白，B为(-)-儿茶素没食子酸酯与SRC，C为3,8-二羟基-10-甲氧基-5-h-异色烯[4,3-b]色烯-7-酮与SRC，D为β-谷甾醇与SRC，E为(-)-儿茶素没食子酸酯与PTGS2，F为3,8-二羟基-10-甲氧基-5-h-异色烯[4,3-b]色烯-7-酮与PTGS2，G为原花青素B1与EGFR，H为β-谷甾醇与BCL2；3D关系中，蓝色实线代表氢键相互作用，灰色虚线代表疏水相互作用，黄色虚线代表盐桥，绿色虚线代表π-π垂直堆叠。图8 关键成分靶点分子对接模式图Fig.8 Molecular docking pattern diagram of key ingredients and targets

3 讨论

金荞麦归肺经，为清热解毒要药，温病名家吴鞠通指出“治上焦如羽，非轻不举”，意在药取辛凉，开已闭之肺，清解风热时邪。其主要成分黄酮、甾体、有机酸等具有抗多种病毒潜力。据核心成分-靶点-信号通路图显示，金荞麦的多种成分可作用于多个靶点，最终通过多条通路起抗RSV作用。其中，黄酮占金荞麦有效成分的33.3%，能够直接作用于多个RSV结构蛋白和体内核心靶点。黄酮类组分能够与病毒多个结构蛋白直接结合，具有直接控制病毒复制的潜力，具有进一步开发的价值[22]。因此，我们推测金荞麦发挥抗RSV最主要的成分为黄酮类组分。

通过基因芯片结果的二次分析可以发现，气道上皮细胞在RSV入侵后的2 h即可做出大量的应答，差异表达基因高达17 720个，部分基因差异倍数较高。金荞麦涉及的关键靶点上游基因均属于差异基因，参与对病毒感染后体内环境的调节。从PPI网络可以看出，SRC、PTGS2、AKT1、VEGFA、EGFR五个靶点蛋白处于网络中心，节点度值高，是金荞麦体内发挥抗病毒功效的核心靶点。KEGG靶点通路富集分析结果表明，金荞麦体内抗RSV涉及30条信号通路，多条与免疫、抗病毒直接相关，是一个复杂的过程。靶点通路分析结果显示，BCL2、STAT3和KDR是重要的枢纽。即金荞麦抗RSV的靶点主要涉及AKT1、VEGFA、PTGS2、SRC、EGFR、KDR、STAT3、BCL2等。其中，SRC是一种酪氨酸的转移性蛋白激酶，广泛存在于各种细胞质中，在病毒感染过程中发挥着重要作用[23]。研究表明，SRC族激酶通过多种机制参与病原微生物的感染过程(如与病原微生物的脯氨酸基序-PXXP互作)[24]。郑刚[25]发现SRC同源酶可促进α-干扰素诱导的Jak/Stat1信号通路，从而抑制RSV复制。分子对接结果显示SRC与金荞麦各个核心成分结合力最强，推测是体内通过免疫途径发挥抗病毒作用的关键途径。KDR是血管内皮生长因子(VEGF)的重要受体之一，结合后可促进内皮细胞分裂、增殖、迁移、加速血管新生。有研究发现病毒侵染后，KDR导致特异性CD8+T细胞激活，导致细胞形态变化，促使细胞增殖和膜通透性增加，可能是后期增强免疫的途径之一[26]。STAT家族蛋白具有广泛的生物学作用，抑制肿瘤生长、促进肿瘤细胞的凋亡、参与固有免疫反应等。STAT在Jak-1和Tyk-2的催化作用下发生磷酸化, Jak-1和Jak-2刺激磷酸化的STAT形成二聚体，并转移至细胞核内，激活抗病毒启动子，介导IFN途径的免疫[27]。STAT1可通过乙酰化、泛素化、甲基化等不同修饰影响干扰素抑制病毒复制[28]。BCL2是线粒体介导的凋亡过程的关键信号因子。Kvansakul等[29]研究发现多种病毒通过调节BCL的同源物以阻断宿主细胞的凋亡和自噬，防止感染细胞过早死亡。该研究提示可从调控细胞凋亡过程入手，阻止病毒在细胞中过度复制。PI3K和AKT参与维持RSV感染过程中细胞活力。PI3K及其下游介质在气道上皮细胞RSV感染过程中，在诱导凋亡和炎症中起重要作用[30]。Monick等[31]研究证明，阻断AKT活化会导致RSV感染的细胞加速凋亡。因此抑制PI3K和AKT过程可能是金荞麦发挥抗RSV感染的途径之一。EGFR可参与上皮细胞的生长、修复和瘤变, 在黏蛋白的分泌、细胞间紧密连接的调控中起重要作用，活化后可抑制气道上皮细胞的抗病毒防御功能[32-33]。刘娟娟等[34]发现RSV可致EGFR活化，促进IL-8释放并抑制细胞凋亡，提示抑制EGFR的活化是降低RSV感染程度的方法。

综上所述，金荞麦抗RSV的15个潜在活性成分直接作用于45个体内靶点与3个病毒结构蛋白靶点，涉及多个基因、蛋白和通路，体现了金荞麦多成分-多靶点-多途径的作用特点，本文还对作用的主要途径绘制了关键靶点通路简图，并通过GEO数据挖掘和分子对接初步验证了核心靶标在PPI 及通路中的枢纽作用，对金荞麦抗病毒机制的进一步研究提供了方向，上述结果与文献报道靶点基本一致。

网络药理学能较好地体现大数据时代生物医药卫生系统性研究的新方向与新趋势，也能适应中医药现代化过程中对研究技术方法的迫切要求。随着多组学以及高通量技术的发展，从整体角度出发，多层次手段挖掘、整合疾病的分子机制与药物作用机制，必将会为金荞麦的现代化开发和应用提供新的思路。