果汁中乙醇质量浓度的抗干扰检测方法

王丙莲，马耀宏，公维丽，杨艳，郑岚，刘庆艾，孟庆军

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 山东省科学院生物研究所，山东 济南 250103)

乙醇质量浓度是检验果汁质量的重要指标，目前国内主要采用国标法测定，即重铬酸钾氧化-硫酸亚铁铵滴定法[1]。该方法耗时较长、操作复杂、条件难控制，所以在实际应用中存在一定弊端。对于乙醇质量浓度的检测还有很多其他方法，如蒸馏法、分光光度法、气相色谱法(gas chromatography, GC)[2]、气质联用法(gas chromatograohy-mass spectrometry ,GCMS)[3]、光谱分析法[4]、生物传感器法[5]等，其中传统的蒸馏法、分光光度法测定精确度低，测定误差大；GC法、GCMS法、光谱分析法等所需设备昂贵、对操作人员要求高、耗时长，不适于实际生产应用。生物传感器法因其灵敏度高、操作简单，近年来发展较快，主要是固定化乙醇氧化酶或乙醇脱氢酶，制成酶电极生物传感器[6-7]，通过其电化学性能变化达到乙醇检测的目的。因为酶催化反应专一性较强，所以酶电极生物传感器用于底物质量浓度测定时，专一性亦较强。但果汁成分复杂，不仅含糖类、脂类、烃类、金属元素，还含电化学活性物质，如维生素C、过氧化氢酶等。这些物质能够诱导底物反应之外的氧化还原反应及电子转移[8-9]，从而导致反应系统出现与待测底物无关的电信号干扰，引起电极信号检测的误差，所以乙醇酶电极生物传感器直接用于果汁乙醇测定时，受电活性干扰物影响较大。本文构建了一种新型不受氧化还原性干扰物影响的乙醇电极检测系统，并与GC法、国家标准法进行了对比实验。结果表明，该方法准确度高、抗干扰性强；回收率、重现性好,更适合低成本要求的检测。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

乙醇氧化酶(Sigma公司进口分装，250U)；氧化石墨烯(实验室自制)；牛血清蛋白(阿拉丁试剂有限公司)；壳聚糖(阿拉丁试剂有限公司)；甘油、戊二醛(国药集团化学试剂有限公司，质量分数25%)，所有化学试剂均为分析纯。

SBA-40E型生物反应系统(山东省科学院生物研究所)；5804R型低速冷冻离心机(德国艾本德公司)；IKA VORTEX 3型漩涡混匀器(德国艾卡公司)；UC型超声波精密喷涂设备(东方金荣超声电气有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 基础电极探头的制备及处理

根据文献[10]将铂丝、银片、热敏电阻、屏蔽电阻等集成一体，制备基础电极探头。晾干后，在电极探头超声雾化滴涂包覆纳米氧化石墨烯层，后室温真空干燥，得到石墨烯均匀修饰的基础电极探头，晾干备用。

1.2.2 工作酶电极的制备

将制备的基础电极探头置于超净台，按本实验室酶固定化技术，将5 U乙醇氧化酶、血清蛋白、甘油、戊二醛进行有序混合，混合液均匀涂布于基础电极探头表面，室温固化干燥，乙醇氧化酶经戊二醛交联剂固定于基础电极探头表面。取质量分数1%壳聚糖水凝胶溶液，滴涂在乙醇氧化酶固定化的电极表面，冷冻干燥，制成乙醇工作酶电极。

1.2.3 辅助酶电极的制备

另取一支基础电极探头，将乙醇氧化酶在80 ℃下加热灭活，将灭活的乙醇氧化酶按照步骤1.2.2固定于基础电极表面，制得乙醇辅助酶电极。

1.3 测定步骤

1.3.1 抗干扰性能检测

将工作酶电极、辅助酶电极作为电极系统，同时安装于SBA-40E生物反应系统，启动仪器，运行系统检测程序。以1 %亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)作为抗干扰性能检测的基础物质，准确进样25 μL，反应20 s。记录各电极相对电信号，其中辅助酶电极相对电信号记为A0、工作酶电极相对电信号记为A1，连续测定3次。计算并比较连续测定时A1/A0，根据A1/A0变化值Δ(A1/A0)，判断整套系统的抗干扰性能。

1.3.2 抗干扰系数计算

通常，欠缺结婚形式要件的法律后果是婚姻不成立，而不是婚姻无效。中俄婚姻法都持此见解，故在婚姻无效的事由中并无欠缺形式要件这一项。

1.3.3 系统定标

再次提示进样时，准确吸取1 mg/mL乙醇标准液，注射入反应池，分别记录工作酶电极和辅助酶电极电信号值，按照公式(1)计算工作酶电极酶活性I，按照公式(2)计算第n次和第n+1次测定的工作酶电极酶活性差值ΔI，n为大于等于1的正整数。

(1)

ΔI=I(n+1)-In

(2)

1.3.4 样品测定

当系统定标通过后，运行样品检测程序。仪器提示进样时，准确吸取25 μL果汁样品注入反应池，按照公式(3)计算果汁中乙醇的质量浓度：

(3)

2 结果与讨论

2.1 抗干扰性能检测结果

K4Fe(CN)6是电化学实验中常被用于研判电极表面的电子活性的氧化还原反应标记物，此处用作基础电化学活性物质，检测电极系统抗干扰性能的稳定性。根据步骤1.3.1，得到表1。结果表明，连续测定3次，A1/A0值保持稳定，变化率(Δ(A1/A0))<1%，即重复测定误差<1%，整套系统抗干扰性能稳定，可用于进一步测定。

表1 抗干扰性能参数Table 1 Anti-interference parameters

2.2 抗干扰系数的确定

(4)

2.3 系统定标结果

以1 mg/ mL乙醇溶液为标准液，根据操作步骤1.3.3，记录工作酶电极和辅助酶电极相对电信号值，并计算各酶电极酶活性，结果见表2。

表2 系统定标数据Table 2 System calibration data

由表2求得乙醇质量浓度计算公式：

(5)

表2表明，底物单一的情况下，辅助酶电极的信号增减情况与工作酶电极一致，且其变化更为剧烈。但两者协同工作时，工作酶电极的酶活能够快速稳定下来，连续测定2次，酶活变化率为0.92%，系统达到定标通过状态。分析其原因，可能辅助酶电极不仅能消除人为进样的误差，而且能够灵敏检测系统的信号波动，通过其与工作酶电极的协同比对，消除不平稳的系统信号，使电极系统更快稳定下来。

2.4 样品测定稳定性检验

根据操作步骤1.3.4，系统提示进样时，准确进样稀释为原质量浓度1/20的乙醇样品25 μL，测定其中乙醇质量浓度，每个测定重复5次。依据2.3实验得到的乙醇质量浓度计算公式(5)，求得乙醇质量浓度，见表3。

表3 果汁中乙醇质量浓度测定结果Table 3 Determination of ethanol concentration in juices

由表3可知，工作酶电极电信号值相对标准偏差为2.18 %，辅助酶电极电信号相对标准偏差为31.82%，但工作酶电极与辅助酶电极协同作用时，乙醇质量浓度测定结果相对标准偏差为0.80 %，表明通过引入辅助酶电极及系统抗干扰系数K(0.895)，进一步提高了检测系统的稳定性和重复性，排除电极信号本身不稳定对乙醇测定的干扰，达到准确、稳定测定的目的。

2.5 回收率检验

取市售果汁样品，3 000 r/min离心5 min，上清液分成等体积的两份。一份加入等体积、质量浓度为10 mg/mL的乙醇溶液，制成加标样品。另一份加入等体积蒸馏水作为对照样品。加标样品和对照样品均稀释10倍，后依据步骤1.3.4和2.3分别测定并计算加标样品和对照样品中乙醇质量浓度，每个测定重复4次。结果表明(表4)，该方法测定果汁中乙醇质量浓度的回收率为99.10%～101.10 %，可初步认为测定结果准确、可靠。

表4 乙醇检测系统的回收率实验Table 4 Recovery test of ethanol detection system

2.6 抗干扰性检验

果汁成分复杂，含有较多干扰物，如维生素、果酸、葡萄糖、蔗糖，少量脂类、芳香烃、过氧化氢酶，以及钙、铁等元素。1 mg/mL乙醇溶液中分别加入维生素C、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、Ca2+、过氧化氢酶等物质，调整干扰物浓度为2 mg/mL，其中，过氧化氢酶活性单位为0.01 U/mL。乙醇检测系统测定乙醇质量浓度，验证这些物质对乙醇测定的影响。结果表明，葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、Ca2+对乙醇测定没有明显影响。维生素C存在时，工作酶电极、辅助酶电极电信号均出现大幅上涨，但经计算所得乙醇质量浓度跟其实际值相较无明显区别。这是因为维生素C具有较强的还原性，是一种灵敏的电化学活性物质，能够在电极表面发生氧化还原反应，引起电极电信号的明显增强，但辅助酶电极的协同作用和比较，恰好消除了这一类非乙醇底物参与产生的电信号，从而实现其对维生素C的抗干扰目的。过氧化氢酶存在时，工作酶电极与辅助酶电极的电信号则均大大低于其他实验组，最终计算得乙醇质量浓度值也与实际值相一致。分析其原因可能是，乙醇底物反应产生的部分过氧化氢被过氧化氢酶催化[11]，故工作酶电极、辅助酶电极所能采集到电信号均降低，辅助酶电极的协同作用，消除了因过氧化氢产物减少引起的信号误差，实现了过氧化氢酶存在情况下的乙醇准确测定。因此，辅助酶电极的存在，能够有效消除果汁中常见干扰物对乙醇检测的影响，达到乙醇准确测定的目的。

2.7 与国家标准、GC法对比实验

取两种市售果汁，分别记为1#、2#，离心稀释，并分别用本实验方法、GC法、国标方法测定乙醇质量浓度，重复4次。T检验比较三种方法的差异显著性(表5)。由表5可知，利用生物传感器法测定果汁乙醇质量浓度时，与GC法相比较，测定结果低，但是差异不明显(P>0.05)。可以认为，工作酶电极和辅助酶电极协同工作，用于测定成分复杂的果汁中乙醇质量浓度时，准确度较高。

表5 乙醇检测系统与国标法、GC法对比实验Table 5 Comparison of ethanol detection system with national standard method and GC

3 结论

本文构建了一种新型的乙醇检测系统，将工作酶电极和辅助酶电极协同作用，建立了乙醇抗干扰测定方法。该方法对果汁中常见干扰物质，诸如糖类、金属离子、柠檬酸的抗干扰能力强。此外，辅助酶电极的存在，不仅能消除电化学活性物质对电信号的干扰，实现对乙醇的抗干扰测定，而且能消除底物中的氧化还原酶对测定的影响。鉴于以上抗干扰性能，该方法不仅能用于果汁中乙醇的测定，还可广泛应用于其他相关行业(如啤酒、果味酒、饮料、调味品等生产中的乙醇测定)发酵过程中乙醇的含量控制，以及血清、血浆中的乙醇测定。因此，该方法在食品行业、发酵行业，甚至血液制品行业均有广阔的应用前景。此外，该方法操作简单、成本低廉且准确度高，能够满足低成本要求的实际生产要求，有望代替国家标准方法或GC法成为乙醇测定的主要手段，对于提高相关领域的生产效率，降低生产成本具有重要意义。