HPLC-MS/MS测定大鼠血浆中杨芽黄素的含量

邓志鹏，李静，赵盼，宋佳

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

杨芽黄素(tectochrysin)为黄酮类化合物，主要来源于姜科多年生植物益智(AlpiniaoxyphyllaMiq.)的干燥成熟果实[1-2]。现代药理学研究表明，杨芽黄素具有抗炎、抗氧化、抗心脑血管疾病等作用[3-6]。近年来的研究表明杨芽黄素对前列腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌等细胞均产生抗肿瘤活性[7-9]。Zhao等[10]用超高效液相色谱-串联质谱(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法对大鼠灌胃给予益智仁后的杨芽黄素和白杨素进行了比较药代动力学研究，但该单体给药后的药代动力学性质至今仍不清楚。本研究采用高效液相色谱-串联质谱技术(high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)，对Wistar大鼠单次灌胃低、中、高剂量(5、10、20 mg/kg)杨芽黄素后，检测大鼠血浆中杨芽黄素量,结果对阐明杨芽黄素在体内的药动学特征以及临床前试验设计具有重要意义。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

UltiMate 3000高效液相色谱仪串联TSQ Quantum Access Max型三重四极杆质谱仪(美国Thermo Scientific)配备电喷雾离子源；Xcalibur 2.1软件系统(美国Thermo Scientific)；PX85ZH型分析天平(美国Ohaus)；Synergy UV-R超纯水仪(法国Millipore)；5427R型高速离心机(德国Eppendorf)；MTV-1型旋涡混合仪(杭州奥盛仪器有限公司)；WD-12氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)。

1.2 实验试剂

杨芽黄素对照品(批号wkq18042810，纯度99.99%)和内标物质珊瑚菜内酯(批号wkq17101106，纯度99.83%)均购自四川省维克奇生物科技有限公司(成都，中国)。色谱纯甲醇和乙腈(美国Tedia)、色谱纯甲酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)，纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司。

1.3 实验动物

15只健康雄性Wistar大鼠，体重(200±20) g，济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，使用许可证号:SCXK(鲁)2019 0003。常规饲料喂养，自由饮水，1周后给药，试验前禁食12 h。

2 方法与结果

2.1 储备液配制

平行精密称取2份5.00 mg杨芽黄素对照品，经精密称定后用色谱甲醇溶解，配制成质量浓度均为500 μg/mL杨芽黄素标准曲线储备液及质控储备液。依次量取适量标准曲线储备液，用色谱甲醇进行逐级稀释，得到质量浓度为5、10、50、100、250、1 000和2 000 ng/mL标准曲线系列工作溶液。取适量质控储备液用色谱甲醇进行稀释，得到质量浓度分别为15、150和1 800 ng/mL的质控系列工作溶液。实际样品测定按上述方法称量及稀释，进行配制相应溶液。

2.2 标准曲线和质控样品配制

精密量取4.5 mL空白大鼠血浆，分别加入0.5 mL标准曲线系列工作溶液，使其血浆中杨芽黄素浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、100.0 、200.0 ng/mL。精密量取4.5 mL空白大鼠血浆，分别加入0.5 mL质控系列工作溶液，得到血浆浓度分别为1.5、15.0、180.0 ng/mL的高、中、低浓度质控样品。

2.3 内标溶液配制

精密称取珊瑚菜内酯对照品约2.00 mg，经精密称定后用色谱甲醇溶解得到浓度为200 μg/mL内标储备液。取该储备液适量，用色谱甲醇进行稀释，得到浓度为20 ng/mL内标工作溶液。

以上所有储备液、标准曲线和质控样品及内标溶液均用经过校正的量瓶配制，放置于4 ℃冰箱内避光保存备用。

2.4 色谱和质谱条件

质谱条件:采用电喷雾电离源(ESI)，毛细管温度为300 ℃，离子源喷射电压为 3.0 kV;正离子方式检测;选择性反应监测(SRM)扫描;氮气用于鞘气和辅助气，流速分别为35 Arb(1 Arb=0.33 L/min)和20 Arb; 驻留时间设置为200 ms。 LC-MS采用选择反应监测模式，用于定量分析的离子对分别为:杨芽黄素m/z268.8→225.9(碰撞能量(CE)为25 eV)和珊瑚菜内酯m/z300.9→233.0 (CE为25 eV)。杨芽黄素和珊瑚菜内酯产物离子全扫描质谱图见图1，推测质谱裂解途径见图2。

图1 二级质谱图Fig.1 MS/MS mass spectra

图2 杨芽黄素和内标物质珊瑚菜内酯的化学结构及推测质谱裂解途径Fig.2 Chemical structures and proposed fragmentation pathways of tectochrysin and phellopterin

2.5 样本处理

从-20 ℃冰箱取出血浆样本，自然解冻，精密吸取50 μL，加入50 μL色谱乙腈(含内标珊瑚菜内酯20 ng/mL)，涡旋混匀后，加入1.5 mL乙酸乙酯，振荡5 min，经11 000 r/min高速离心10 min后吸上清液至干净试管中，经浓缩仪40 ℃氮气吹干，再加入200 μL流动相复溶残渣后过经0. 22 μm滤膜，精密吸取5 μL样品进行进样检测。

2.6 方法学研究

2.6.1 专属性

取空白血浆50 μL，加入150 μL纯乙腈，按2.5项下方法操作，得空白样品色谱图(图3(a))。分别取标准曲线最低定量限(LLOQ)和最高定量限(ULOQ)样品50 μL，按2.2项下方法操作，得含内标的色谱图(图3(b)和3(c))。取给药后0.5 h的血浆样品50 μL，按2.5项下方法操作，得血浆样品质谱图(图3(d))。杨芽黄素和内标的保留时间分别为3.1 min和2.7 min，内源性物质和内标均不干扰待测物的精确定量分析。

图3 典型SRM色谱图Fig.3 Representative SRM chromatograms

2.6.2 标准曲线和定量下限

按照2.5项下方法制备标准曲线样品，记录杨芽黄素和内标色谱峰面积，以待测物杨芽黄素和内标峰面积比值为纵坐标y，杨芽黄素的血浆浓度为横坐标x，权重系数为1/X2，进行线性回归。杨芽黄素血药质量浓度为0.5～200.0 ng/mL，标准曲线方程为:y=0.066 85x+0.008 950,r2=0.996 9，线性关系良好，满足分析要求，最低定量限为0.5 ng/mL。

2.6.3 精密度与准确度

按2.2项下方法操作分别配制的高、中、低浓度杨芽黄素质控样品(180.0、15.0、1.5 ng/mL)，每个浓度做5个样本分析。连续测定3个分析批次，计算该方法的日内和日间精密度和准确度，其中精密度用相对标准偏差δRSD进行衡量，准确度用相对误差(ER)进行评价，结果见表1。结果表明杨芽黄素的日内、日间精密度和准确度均符合《生物样品定量分析方法验证指导原则》[11]。

表1 大鼠血浆中QC 样品的精密度和准确度(n=5)Table 1 Precision and accuracy of QC samples in evaluating tectochrysin in rat plasma (n=5)

2.6.4 基质效应和提取回收率

取6个不同来源的大鼠空白血浆50 μL，按照2.5项下方法取上层清液，分别加入高、中、低浓度(180.0、15.0、1.5 ng/mL)的杨芽黄素工作液及内标混合工作液，进样2 μL，记录杨芽黄素及内标峰的面积(A)；用水代替大鼠空白血浆，取上层清液，分别加入相当于高、中、低浓度(180.0、15.0、1.5 ng/mL )杨芽黄素工作液及内标混合工作液，进样2 μL，记录相应样本的杨芽黄素峰及内标峰的面积(B)；取低、中、高 3 个浓度质控样品按2.5项下操作，每一浓度进行6样本分析得峰面积(C)。由A/B×100%分别计算杨芽黄素和内标的基质效应，由(C/A)×100% 分别计算杨芽黄素和内标的提取回收率，见表2。结果显示基质效应值均在85%～115%之间，满足分析要求。

表2 LC-MS/MS 法测定空白血浆中杨芽黄素的提取回收率及基质效应 (n=6)Table 2 Determination of the recovery rate and ME of tectochrysin in rat plasma using LC-MS/MS (n=6)

2.6.5 稳定性考察

按2.2项下方法操作制备成浓度分别为180.0、15.0、1.5 ng/mL高、中、低浓度质控稳定性考察样品(n=6)。所有样品分别经室温放置8 h、-20 ℃长期冷冻30 d后、反复冻融3次和进样室放置6 h后杨芽黄素浓度ER值在-13.80%～8.44%(表3)，表明杨芽黄素的大鼠血浆样品在上述条件下放置后保持稳定。

表3 不同条件下大鼠血浆中杨芽黄素的稳定性结果(n=5)Table 3 Results of the stability of tectochrysin in rat plasma under different conditions (n=5) 单位：%

2.7 药动学应用

15只大鼠随机分为低、中、高3个剂量组(每组5只大鼠)。所有动物禁食但可自由饮水，按照5、10、20 mg/kg给药剂量分别灌胃给予杨芽黄素混悬液(称取药粉适量，加入0.5%CMC-Na溶解，分别配制成0.5、1.0、2.0 mg/mL杨芽黄素混悬液; 给药体积10 mL/kg)，于给药后5 min、 10 min、 20 min、 30 min和1、 2、 4、 6、 8、 12、 24 h眼眶静脉丛采血约250 μL，置肝素钠抗凝管中，经4 000 r/min离心后制备血浆，置于-20 ℃中冰箱储存，待测。将血浆样品按照2.5项下方法处理后，再按照2.4项下色谱和质谱条件进样测定，记录峰面积，绘制药时曲线，其平均血浆浓度-时间分布如图4所示。应用DAS 2.1软件，按统计矩原理，计算药动学参数，给药后的主要药代动力学参数见表4。结果表明大鼠灌胃给药后，杨芽黄素的吸收速度较快，达到峰值浓度的时间Tmax数值为0.30～0.37 h,最大血药浓度值Cmax为25.4～74.5 ng/mL，而药时曲线下面积AUC0～t值从42.6～187.1(ng/mL·h)，在给药剂量范围(5～20 mg/kg)，杨芽黄素的药代动力学行为表现为线性药代动力学性质。平均消除半衰期t1/2为2.4～3.4 h，表明灌胃给药后杨芽黄素在大鼠体内消除速率适中，与描述杨芽黄素在大鼠体内药代动力学特征的先前文献相比[10]，在本研究中获得的杨芽黄素的药代动力学参数普遍相似。

图4 大鼠灌胃给药杨芽黄素后的药时曲线 (n=5)Fig.4 Concentration versus time curve of tectochrysin in rats after oral administration (n=5)

表4 大鼠灌胃给药杨芽黄素后的体内药动学参数Table 4 Pharmacokinetic parameters of tectochrysin n=5)

3 讨论与结论

3.1 色谱及质谱条件优化

LC-MS/MS技术具备快速的方法开发和高通量分析，被公认为是提高通量、灵敏度以及具有更好色谱峰分辨率的一种检测方法[12]。为了获得最佳MS优化参数，电喷雾离子化、毛细管温度(280～350 ℃)、离子源喷射电压(3 000～3 500 V) 和碰撞能量 (0～45 eV)，通过配制标准溶液进行研究。正离子模式检测的电喷雾离子化显示有更高灵敏度，并且在离子源喷射电压为3.0 kV和碰撞能量为25 eV情况下杨芽黄素产生m/z225.9主要碎片离子。因此，选择m/z268.8→225.9用于SRM模式中的LC-MS/MS进一步检测。分析物杨芽黄素的质谱离子化效率受流动相组成的影响。0.1%甲酸水溶液增加了杨芽黄素检测灵敏度，乙腈作为有机相在等度洗脱下，获得了满意的色谱图。空白血浆和加入分析物的血浆典型SRM色谱图如图3所示。结果表明，在杨芽黄素和内标的保留时间内未检测到干扰峰。

3.2 样品制备优化

采用蛋白沉淀法和液-液萃取法对生物样品进行预处理，结果表明蛋白沉淀法回收率低，且受生物样品的干扰，不适合提取杨芽黄素和内标物质。液-液萃取的样品纯度较高，色谱峰或干扰峰中杂质较少。基于杂质峰数少、背景噪声低、蒸发快的特点，作者考察了乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷等几种提取溶剂，发现乙酸乙酯作为提取剂待测物峰型良好，且提取回收率高于其他溶剂。因此，生物样品的制备最终选择了乙酸乙酯作为提取溶剂的液-液萃取法。

3.3 方法学和药动学方面

杨芽黄素结构上属于黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗心脑血管疾病等作用[3-6]。本文提供了一种测定大鼠血浆中杨芽黄素浓度的方法。以珊瑚菜内酯作为内标，其质谱响应模式一致和色谱保留行为接近。采用液-液萃取法预处理血浆样本后，经液相色谱-串联质谱系统检测，内标法计算得到大鼠血浆中杨芽黄素浓度。建立的方法具有选择性和灵敏度高，线性范围宽，样品制备简便等特点，可用于临床前药代动力学研究中杨芽黄素在大鼠血浆中浓度的测定。大鼠经灌胃给药后，杨芽黄素在大鼠体内吸收较快。