响应面法优化紫甘蓝泡菜亚硝酸盐测定的预处理条件

陈雪梅，先琳，勾选枝，黎英

(1.龙岩学院 生命科学学院，福建 龙岩 364012；2.闽西特色农产品精深加工公共服务平台，福建 龙岩 364012)

泡菜是我国传统特色发酵食品的典型代表之一，作为流行较广的民间食品，其历史悠久、生产成本低、制作工艺简单，所得产品脆嫩芳香、口感独特，深受广大消费者的喜爱，有着广阔的市场。但是，泡菜在发酵期间，乳酸菌之外的一些杂菌(肠杆菌、假单胞菌、黄杆菌属和葡萄球菌属)生长繁殖产生的硝酸盐还原酶会将蔬菜本身含有的硝酸盐还原成亚硝酸盐[1-2]。过量的亚硝酸盐不仅会使血液中的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，从而导致血液失去运输氧的能力而引起组织缺氧，而且会与各种胺类反应生成亚硝胺，产生极强的致癌作用[3-4]。因此，亚硝酸盐一直都是泡菜食用安全的重要监测项目之一。

目前，测定食品中亚硝酸盐的依据是GB 5009.33-2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》，其中，第二法(即盐酸萘乙二胺法)是历年国家标准中都有的方法。该方法的样品预处理条件适合肉制品，对于其他样品仅可作为参考[5]。本法利用亚硝酸盐在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1-萘基乙二胺耦合形成紫红色化合物[6]，使用分光光度计测定吸光度，与标准进行定量比较，且一般的实验室都具备其测定条件。但在实验过程中发现，紫甘蓝等具有花青素的泡菜在预处理过滤后的溶液仍具有一定的颜色，主要原因是乙酸锌-亚铁氰化钾溶液脱色能力较差；另外，泡菜在发酵过程中会产生乳酸等有机酸，有机酸的累积会改变样液的pH值[7]，这都严重影响了比色测定结果。因此，对于带有天然色素的泡菜样品，在测定亚硝酸盐时有必要对泡菜预处理条件进行改进或优化。

本实验以紫甘蓝泡菜为样品，研究测定亚硝酸盐含量时样品的预处理方法。采用饱和硼砂溶液进行常温振荡提取，再用活性炭和乙酸锌-亚铁氰化钾溶液进行脱色澄清，通过单因素实验和响应面实验研究样品预处理时活性炭、硼砂饱和溶液、提取时间和沉淀剂对亚硝酸盐测定的影响，以加标样品的回收率为指标，优化或改进预处理条件，以期解决泡菜中天然色素和有机酸对测定的干扰，从而取得更准确的测定结果。

1 材料与方法

1.1 实验器材

1.1.1 实验材料

紫甘蓝泡菜：自制，参考文献[8-9]制作。

1.1.2 实验设备

JA202电子天平 上海浦春计量仪器有限公司；JYL-C19V九阳料理机 九阳股份有限公司；ZWYR-200D恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；PH-3C精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；UV-1800紫外可见分光光度计 厦门柏嘉生物科技有限公司。

1.2 实验试剂

硼酸钠、亚硝酸钠、乙酸锌、亚铁氰化钾、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、冰醋酸、活性炭粉等：均为AR级。

1.3 实验方法

1.3.1 亚硝酸盐标准曲线的绘制

准确移取0.00，0.40，0.80，1.20，1.60，2.00，2.50 mL 5 μg/mL亚硝酸盐标准使用液(相当于0，2，4，6，8，10，12.5 μg亚硝酸盐)分别置于25 mL比色管中，于各管中加入4 g/L对氨基苯磺酸溶液2 mL，混匀，静置3～5 min后，各加入2 g/L盐酸萘乙二胺溶液1 mL，加水至刻度，混匀，静置15 min，用1 cm比色杯，以零管调节零点，于波长538 nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标，以标准系列中的亚硝酸盐质量为横坐标，绘制标准曲线，计算线性方程。

1.3.2 紫甘蓝泡菜亚硝酸盐的测定方法

1.3.2.1 紫甘蓝泡菜的预处理

取紫甘蓝泡菜10.0 g→加1倍水匀浆→用100 mL水移至250 mL三角瓶中→加一定量的饱和硼砂溶液和活性炭→常温振荡提取一定时间→转移至250 mL容量瓶中→加沉淀剂(220 g/L乙酸锌、106 g/L亚铁氰化钾)→定容→静置30 min→过滤→弃去前30 mL滤液，收集后面的滤液备用。

1.3.2.2 紫甘蓝泡菜亚硝酸盐的测定及计算

取样品滤液20 mL→显色→定容至25 mL→于538 nm处测定吸光度→由线性方程计算20 mL样品滤液中亚硝酸盐质量x→计算样品中亚硝酸盐质量分数ω。

式中：ω为样品中亚硝酸盐的质量分数，mg/kg；x为20 mL样品滤液中亚硝酸盐的质量，μg；m为紫甘蓝泡菜的质量，g；250为样品处理液总体积，mL；20为比色时取样品滤液体积，mL。

1.3.3 紫甘蓝泡菜预处理条件的研究

采用单因素实验，分别研究紫甘蓝泡菜样品预处理时饱和硼砂用量、活性炭用量、提取时间、沉淀剂用量对亚硝酸盐测定的影响，以加标样品回收率为指标，筛选出回收率接近100%的预处理条件。然后在单因素实验的基础上采用响应面实验对预处理条件进一步优化。

1.3.4 加标样品回收率的计算

取两份重量相同的紫甘蓝泡菜，其中一份添加5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液5 mL作为加标样品。将两份样品采用相同的方法进行预处理并分别测定亚硝酸盐含量，计算亚硝酸盐回收率P：

式中：m为紫甘蓝泡菜的质量，g；ω1为样品中亚硝酸盐的质量分数，mg/kg；ω2为加标样品中亚硝酸盐的质量分数，mg/kg；m0为加入的亚硝酸盐标准物质的质量，μg。

2 结果与分析

2.1 亚硝酸盐的标准曲线

以吸光度为纵坐标、亚硝酸盐质量(μg)为横坐标，绘制的标准曲线见图1。

图1 亚硝酸盐的标准曲线Fig.1 Standard curve of nitrite

由图1可知，亚硝酸盐质量在0～12.5 μg范围内与吸光度呈良好的线性关系。回归方程为y=0.0279x+0.0086，相关系数为R2=0.9971。

2.2 紫甘蓝泡菜预处理的单因素实验结果

2.2.1 活性炭用量对亚硝酸盐测定的影响

取紫甘蓝泡菜6份，匀浆，同时准备各加标样品。在固定饱和硼砂溶液6.5 mL、常温下200 r/min振荡提取30 min、沉淀剂乙酸锌-亚铁氰化钾溶液各5.0 mL的条件下，研究活性炭用量(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g)对亚硝酸盐回收率的影响，结果见图2。

图2 活性炭用量对亚硝酸盐回收率的影响Fig.2 Effect of activated carbon dosage on the nitrite recovery rate

由图2可知，随着活性炭用量的增加，回收率先降低再升高，然后再降低。活性炭的主要作用是脱除样品中含有的天然色素花青素，同时也能澄清滤液。实验过程中发现，当不添加活性炭时，样品滤液呈微紫红色，显色后颜色非常深，吸光度为0.489～0.522，超出测定标准曲线时的吸光度范围，但回收率仅有58.9%。可见，紫甘蓝中天然色素对亚硝酸盐的比色测定造成很大的干扰。使用活性炭后，样品滤液变得澄清无色。由于活性炭用量不同，其对紫甘蓝色素的脱除率也不同，而紫甘蓝色素是由多种花色苷组成的，颜色的变化受pH值的影响较大[10]，所以不同活性炭用量预处理样品后测得的亚硝酸盐回收率不同。当活性炭用量为0.4 g时，亚硝酸盐回收率最接近100%。

2.2.2 饱和硼砂溶液用量对亚硝酸盐测定的影响

取紫甘蓝泡菜5份，匀浆，在活性炭用量0.4 g、常温下200 r/min振荡提取30 min、沉淀剂乙酸锌-亚铁氰化钾溶液各5.0 mL的条件下，研究饱和硼砂溶液分别为0，3.5，6.5，9.5，12.5 mL时对亚硝酸盐回收率的影响，结果见图3。

由图3可知，随着饱和硼砂溶液用量的增加，回收率先升高再降低。饱和硼砂溶液是亚硝酸盐的提取剂，测定不同饱和硼砂用量下提取液的酸碱性，其pH值分别为4.15，8.79，9.08，9.17，9.22，可见亚硝酸盐在pH为9.0左右时提取回收率较高。当饱和硼砂用量由6.5 mL增加至12.5 mL时，pH由9.08增加至9.22，增幅缓慢，有类似缓冲溶液的作用。而盐酸萘乙二胺法的显色必须在弱酸性条件下，过多的饱和硼砂溶液会影响后续显色反应的酸碱性，这可能也是硼砂用量多时回收率降低的原因。饱和硼砂用量为6.5 mL时，回收率最接近100%。

图3 饱和硼砂溶液用量对亚硝酸盐回收率的影响Fig.3 Effect of saturated borax solution dosage on the nitrite recovery rate

2.2.3 提取时间对亚硝酸盐测定的影响

将匀浆后的紫甘蓝泡菜平均分成5份，在各样品中加入饱和硼砂溶液6.5 mL、活性炭0.4 g，分别于常温下200 r/min振荡提取10，15，20，25，30 min，然后加入乙酸锌-亚铁氰化钾溶液各5.0 mL，过滤后取样品滤液显色测定。样品提取时间对亚硝酸盐回收率的影响见图4。

图4 提取时间对亚硝酸盐回收率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the nitrite recovery rate

由图4可知，随着提取时间的延长，回收率变化幅度不大，在95%～105%范围内波动，说明提取时间对亚硝酸盐的影响不大。主要原因是亚硝酸盐易溶解于水，只要样品匀浆均匀，就有利于亚硝酸盐的溶解和提取。出于节约时间成本的考虑，选择后续实验的提取时间为10 min。

2.2.4 沉淀剂对亚硝酸盐测定的影响

固定饱和硼砂溶液6.5 mL、活性炭0.4 g、常温下200 r/min振荡提取10 min，研究沉淀剂乙酸锌-亚铁氰化钾溶液分别为0，1.0，3.0，5.0 mL时对亚硝酸盐回收率的影响，结果见图5。

图5 沉淀剂用量对亚硝酸盐回收率的影响Fig.5 Effect of precipitant dosage on the nitrite recovery rate

乙酸锌和亚铁氰化钾溶液在使用时等体积混合，通过反应会生成氰亚铁酸锌沉淀，能吸附样品中的蛋白质、果胶等干扰物质，从而使样液澄清。实验发现，不添加沉淀剂的样品滤液浑浊色暗，从而导致吸光度增大，回收率远高于100%。而添加沉淀剂的样品滤液澄清透明，随着沉淀剂用量的增加，回收率先上升再下降，当沉淀剂用量为3.0 mL时，回收率最接近100%，且沉淀剂由3.0 mL增加至5.0 mL时，回收率略有下降，但变化幅度不大。

2.3 紫甘蓝泡菜预处理条件的优化

2.3.1 响应面实验设计及结果

单因素实验结果表明，紫甘蓝泡菜预处理时活性炭用量、饱和硼砂用量和沉淀剂用量对亚硝酸盐的测定影响较明显。为了获得更好的预处理条件，选择活性炭(A)、饱和硼砂溶液(B)、沉淀剂(C)3个因素，以亚硝酸盐回收率(Y)为响应值，采用Design-Expert 7.0软件提供的Box-Behnken Design设计17组实验进行回归分析，分析各因素及各因素之间的交互作用对响应值的影响，并建立数学模型。实验的因素水平见表1，实验结果见表2。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

表2 响应面实验设计方案及结果Table 2 The response surface experimental design scheme and results

续 表

由Design-Expert 7.0软件分析可得，响应值(回收率Y)与各因素之间的回归方程为：Y=101.02+2.44A-3.30B-1.66C-2.68AB+0.35AC-1.02BC-4.89A2-1.46B2-6.23C2。

由表3可知，该回归模型的影响显著(P=0.0011<0.05)，失拟项不显著(P=0.5894>0.05)，说明该回归模型与实际情况拟合程度良好，且3个因素对亚硝酸盐回收率的影响均达显著水平(P<0.05)，影响大小的顺序为B(饱和硼砂溶液)>A(活性炭)>C(沉淀剂)，可见该回归模型中3个因素对紫甘蓝泡菜亚硝酸盐回收率的影响是可信的，用该方程进行分析和预测，预测值和实际测定值之间相关性较高。

表3 Box-Behnken实验设计的回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model of Box-Behnken test design

2.3.2 响应面分析与优化

活性炭(A)、饱和硼砂溶液(B)、沉淀剂(C)3个因素交互作用对亚硝酸盐回收率的影响见图6。

由图6可知，AB交互作用的曲面相对陡一些，说明活性炭和饱和硼砂溶液交互作用对回收率的影响更显著。根据回归模型方程预测回收率为100%的最佳预处理条件是活性炭0.40 g，饱和硼砂溶液7.85 mL，沉淀剂乙酸锌-亚铁氰化钾溶液各4.04 mL。在实际操作中将预处理条件适当调整：活性炭0.40 g，饱和硼砂溶液7.80 mL，沉淀剂乙酸锌-亚铁氰化钾溶液各4.00 mL，其他条件为常温下200 r/min振荡提取10 min。

2.3.3 最佳预处理条件的确定

用改进后的最佳预处理条件和GB 5009.33-2016第二法中的预处理方法分别对紫甘蓝泡菜及加标样品进行预处理并测定亚硝酸盐，做3次平行实验，所得实验现象和回收率见表4。

表4 两种方法的实验现象及回收率Table 4 Experimental phenomenon and recovery rate of two methods

由表4可知，采用国标方法所得滤液带有一定颜色，平均回收率为81.3%，3次平行实验的相对标准偏差RSD=2.42%。采用改进的预处理方法所得的滤液无色、澄清、透明，平均回收率为98.5%，与国标方法测得的回收率相比，测定结果的准确性更高；由于消除了样品天然色素的干扰，3次平行实验的相对标准偏差也比较小，RSD=0.30%。可见，改进的预处理方法不仅提高了测定结果的准确性，而且稳定性和重现性也较好。

3 结论

以紫甘蓝泡菜为样品，采用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐含量，样品预处理方法如下：取紫甘蓝泡菜10.0 g，加水匀浆，加7.80 mL饱和硼砂溶液和0.40 g活性炭，常温200 r/min振荡提取10 min，加入沉淀剂乙酸锌-亚铁氰化钾溶液各4.00 mL，定容至250 mL，静置30 min，过滤，弃去前30 mL滤液，收集后面的滤液备用。

通过对国标预处理方法适当改进，可得无色澄清样液，平均加标回收率为98.5%，与国标方法测得的回收率相比，测定结果不仅准确性更高，而且稳定性更好。