月桂酰精氨酸乙酯的抗菌活性及对牦牛鲜肉肠贮藏品质的影响

彭美玲，郝刚*，唐善虎，李思宁，蔡寅川

(1.西南民族大学 食品科学与技术学院，成都 610041；2.四川阿坝州工业经济研究所，四川 汶川 623000)

月桂酰精氨酸乙酯(lauroyl arginine ethyl ester，LAE)是一种新型食品保鲜剂，在不同基质食品中的抗菌性能有差别[1]。LAE在体内可分解为月桂酸和精氨酸乙酯，安全性较好[2-3]。LAE对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌和酵母均有抑菌作用[4]。2005年，美国FDA将LAE列为一般公认(Generally Recognized as Safe，GRAS)的食品添加剂，可添加到畜、禽肉类食品中[5]。2007年，欧洲食品安全管理局(EFSA)批准了LAE的食品安全认证[6]。根据卫健委《食品添加剂新品种管理办法》相关规定，2018年，我国国家食品安全风险评估中心发布了关于食品添加剂LAE的征求意见，内容中规定了LAE用于新鲜果蔬的最大添加量为200 mg/kg[7]。LAE可通过直接添加或制成包装薄膜的方式应用于肉制品、乳制品、果蔬产品的保鲜[8-10]。LAE可与其他水溶性保鲜剂复配以提高其保鲜能力[11-13]。有报道表明LAE与山梨酸钾有协同抗菌作用，LAE与山梨酸钾复配能够抑制榨菜中微生物增殖1～2个数量级[14]。将LAE、尼泊金和壳聚糖复配用于青椒的防腐保鲜，结果显示其对青椒具有显著的保鲜效果[15]。因牦牛生活在高海拔、低氧浓度的高寒极端环境，牦牛肉形成了独特的肉品品质，具有高蛋白、富含多种氨基酸、低脂肪的特质，营养价值极高[16]，但牦牛肉制品在贮藏过程中容易受到微生物污染导致变质[17]，因此，探究牦牛肉的保鲜方法显得尤为必要。目前国内外研究肉类保鲜的方法诸多[18]，添加保鲜剂是其中之一。壳聚糖(chitosan, CS)与乳酸链球菌素(Nisin)是抗菌保鲜效果显著且生物相容性较好的天然食品保鲜剂[19]。本文研究了月桂酰精氨酸乙酯的抑菌活性以及将月桂酰精氨酸乙酯、壳聚糖和乳酸链球菌素复配用于牦牛鲜肉肠的保鲜，考察其对牦牛鲜肉肠贮藏品质的影响。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

猪肥膘：购于成都正规农贸市场；体质健壮的3岁龄公牦牛背最长肌：购于四川红原牦牛肉食品有限公司；食盐、鸡精、五香粉、料酒：购于红旗超市。

1.2 实验主要试剂

月桂酰精氨酸乙酯(BR)：成都傲飞生物化学品有限责任公司；壳聚糖(食品级)：深圳市星牧生物工程有限公司；乳酸链球菌素(食品级)：山东元泰生物工程有限公司；石油醚(沸程30～60 ℃)、无水乙醇、酚酞、氢氧化钾、三氯乙酸(TCA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-硫代巴比妥酸(TBA)、酚酞、氯仿、氯化钠(AR)、酵母提取物、蛋白胨、琼脂粉、马铃薯培养基(BR)：成都科隆化学品有限公司；多聚甲醛(AR)：天津致远化学试剂有限公司。

实验菌株：绿脓杆菌(PeseudomonasaeruginosaCMCC10104)、枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCMCC63501)、英诺克李斯特菌(ListeriainnocuaATCC33090)、白假丝酵母(CandidaalbicansATCC10231)、黑曲霉(AspergillusnigerCMCC98003)：购于海博生物技术有限公司；鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellatyphimuriumATCC14028)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureussubsp. ATCC29213)、弗氏柠檬酸杆菌(CitrobacterfreundiiATCC51459)、大肠杆菌(EscherichiacoliATCC51459)：由本校动物营养与饲料科学实验室提供。

1.3 实验仪器

BSA224S-CW型电子天平 赛多利斯仪器有限公司；WF32型色差仪 深圳威孚光电科技有限公司；XR53648型电热恒温水浴锅 金坛区西城新瑞有限公司；UV1810S型紫外可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；5810R型台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司；SW-CJ-1FD型洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；ZWY-2102C型恒温振荡培养器 上海智城分析仪器制造有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 牦牛鲜肉肠的制作

将原料(牦牛肉∶猪肥膘为7∶3)、辅料(原料以100%计，食盐3.5%，鸡精0.4%，五香粉0.5%，料酒1.0%)充分混匀，置于4 ℃冰箱中腌制24 h，分别将LAE各保鲜组分混入腌制完毕的牦牛肉中混合均匀后搅碎，灌装成长度约为5 cm的肠体，用排气针扎眼排除肠内气体后置于4 ℃冰箱中贮藏，于第1，3，6，9，12，15天测定指标，各实验处理组如下：

对照组：将牦牛肉、猪肥膘与辅料充分混匀后灌肠，不添加保鲜剂。

低浓度LAE组：将牦牛肉、猪肥膘与辅料再加入0.1 g/kg LAE，混匀后灌肠。

高浓度LAE组：将牦牛肉、猪肥膘、辅料再加入0.3 g/kg LAE，混匀后灌肠。

LAE+Nisin组：将牦牛肉、猪肥膘、辅料再加入0.2 g/kg LAE+0.3 g/kg Nisin，混匀后灌肠。

LAE+CS组：将牦牛肉、猪肥膘、辅料再加入0.2 g/kg LAE+5 g/kg CS，混匀后灌肠。

LAE+Nisin+CS组：将牦牛肉、猪肥膘、辅料再加入0.2 g/kg LAE+0.3 g/kg Nisin+5 g/kg CS，混匀后灌肠。

1.4.2 LAE的抗菌活性测定

1.4.2.1 细菌的培养

将用平板活化后的细菌转接到LB液体培养基中，置于37 ℃恒温振荡培养箱中培养10 h，11000 r/min离心5 min弃上清液，加入无菌生理盐水清洗1次后再以11000 r/min离心5 min弃上清液，沉淀用LB液体培养基稀释为1×108CFU/mL作为待测菌液。

1.4.2.2 真菌的培养

取经平板活化的真菌转接到PDA液体培养基中，置于28 ℃恒温振荡培养箱中培养24 h后，11000 r/min离心5 min弃上清液，加入无菌生理盐水清洗1次后再以11000 r/min离心5 min弃上清液，沉淀用PDA液体培养基稀释为4×104CFU/mL作为待测菌液。

1.4.2.3 最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)测定法

将培养至对数生长期的细菌和真菌的待测菌液分别加入96孔细胞培养板中，每孔中加入100 μL待测菌液，随后加入经倍比稀释的LAE溶液100 μL，LAE的浓度分别为4，8，16，32，64，128 μg/mL，以多聚甲醛为阳性对照，无菌水为阴性对照。细菌置于37 ℃恒温振荡培养箱中培养6 h，每隔0.5 h用酶标仪测630 nm处的吸光值。真菌置于28 ℃恒温振荡培养箱中培养8 h，每隔0.5 h用酶标仪测630 nm处的吸光值，吸光值与初始值相比，没有显著变化的最小LAE浓度为LAE对该菌的最低抑菌浓度。

按最低抑菌浓度(MIC)测定法测定LAE对英诺克李斯特菌等革兰氏阳性菌、绿脓杆菌等革兰氏阴性菌、白色念珠菌等真菌的抗菌活性。

1.4.3 酸价的测定

参考GB 5009.229-2016《食品中酸价的测定》测定牦牛鲜肉肠的酸价。

1.4.4 色度的测定

将牦牛肉肠横切成1 cm高的圆柱体，用色差计测定肉肠切面的亮度值L*、红绿值a*、黄蓝值b*，每个样品测定3次取平均值，仪器使用前用标准板校正[20]。

1.4.5 硫代巴比妥酸值(TBA)的测定

参考GB 5009.181-2016《食品中丙二醛的测定》方法进行测定。

1.5 持水性测定

参考仪淑敏等[21]的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 LAE的抗菌活性检测

采用MIC法考察了LAE对绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌、英诺克李斯特菌等微生物的抑菌活性。LAE对各菌的最低抑菌浓度见表1，对大肠杆菌、绿脓杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、英诺克李斯特菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉的MIC分别为32，32，64，32，16，16，8，16，32 μg/mL。LAE对各种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌都有显著的抑制作用，具有广谱抗菌活性，且对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于革兰氏阴性菌。

表1 最低抑菌浓度(MIC)Table 1 The minimum inhibitory concentration (MIC)

2.2 牦牛鲜肉肠贮藏过程中酸价的变化

酸价是用来衡量肉与肉制品酸败程度的重要指标[22]。牦牛鲜肉肠酸价的变化见图1。

图1 牦牛鲜肉肠贮藏过程中酸价的变化

由图1可知，各处理组在15 d贮藏期内的酸价均呈现增加的趋势(P<0.05)，第1天各处理组的酸价变化差异不显著(P>0.05)，牦牛鲜肉肠贮藏过程中酸价逐渐增大的原因一方面是在贮藏过程中肉肠内源性脂肪酶水解脂肪生成游离脂肪酸，另一方面是牦牛肉肠中的脂肪随着贮藏时间的延长，由于热和微生物的作用而逐渐水解生成游离脂肪酸[23]。对照组在15 d贮藏期内酸价增加的趋势最为显著(P<0.05)，第15天时达1.19 mg/g，LAE对酸价的增加有一定的抑制作用，且浓度越大，抑制作用越明显。LAE+Nisin 与LAE+CS复配组能协同抑制由于微生物繁殖导致的酸价增加，后者的抑制作用更明显，说明LAE+CS协同抑制酸价增加的效果优于LAE+Nisin复配。3种保鲜剂复配时，第15天时酸价增加最小，抑制酸价增加的效果最强。

2.3 牦牛鲜肉肠贮藏过程中色度的变化

2.3.1 牦牛鲜肉肠贮藏过程中L*值的变化

肉制品的色泽是影响消费者购买与否的重要因素，对肉肠颜色感官评价可对牦牛鲜肉肠的新鲜度进行快捷简单的评定。贮藏期间牦牛肉肠的L*值变化见表2。

表2 牦牛鲜肉肠贮藏过程中L*值的变化Table 2 Changes of L* values of yak meat sausage during storage

由表2可知，在15 d贮藏期内各处理组的L*值总体呈现下降的趋势(P<0.05)，对照组的下降趋势较为明显，第1天时各处理组的L*值变化差异不显著(P>0.05)。添加LAE后肉肠亮度的下降趋势略减缓，高浓度LAE和低浓度LAE对亮度值的影响不大，LAE+Nisin与LAE+CS复配组在一定程度上可抑制亮度降低，且LAE+CS的复配效果优于LAE+Nisin。LAE+Nisin+CS的复配效果最好，说明LAE与两种保鲜剂复配后有较为显著的护色作用。

2.3.2 牦牛鲜肉肠贮藏过程中a*值的变化

牦牛鲜肉肠贮藏期内各处理组的a*值变化见表3。

表3 牦牛鲜肉肠贮藏过程中a*值的变化Table 3 Changes of a* values of yak meat sausage during storage

肉色能直观反映肉的新鲜程度，a*值越大表示肉色越鲜红，其变化主要是由于肌红蛋白(Mb)的几种存在方式，即鲜红色氧合态MbO2、褐红色氧化态MMb以及紫红色还原态Mb相互转化的速率来决定的，而MMb还原速率或Mb氧合速率越快，则MbO2的含量越高，肉色越鲜红，a*值越大。由表3可知，牦牛肉肠在贮藏期内各处理组的a*值总体呈现下降的趋势(P<0.05)，第1天和第3天各处理组的a*值变化差异不显著(P>0.05)，高浓度LAE组的a*值在第15天时略高于低浓度LAE组，说明LAE的浓度对a*值有一定影响，且浓度越大护色能力越强。第6天后各组的a*值变化差异显著(P<0.05)，高浓度LAE组与LAE+Nisin复配组在第15天时a*值变化差异不显著(P>0.05)。第15天时LAE+Nisin组与LAE+CS组的a*值变化差异显著，LAE+CS组的a*值高于LAE+Nisin组，说明CS的护色效果明显优于Nisin，3种保鲜剂复配效果最好，因壳聚糖具有良好的抗氧化效果，在实验过程中能显著延缓血红蛋白及类胡萝卜素等呈色物质氧化，LAE与另外两种保鲜剂均具有一定抗菌能力，在牦牛肉贮藏过程中可有效延缓由于微生物生长导致的肌肉组织水分流失与结构的损坏[24]。

2.3.3 牦牛鲜肉肠贮藏过程中b*值的变化

牦牛鲜肉肠贮藏期内各处理组的b*值变化见表4。

表4 牦牛鲜肉肠贮藏过程中b*值的变化Table 4 Changes of b* values of yak meat sausage during storage

由表4可知，随着贮藏时间的延长，各处理组的b*值呈现逐渐上升的趋势(P<0.05)。随着贮藏时间的延长，肉肠会发生腐败，细菌等微生物在肠体内不断生长繁殖，部分蛋白被分解，使得肉肠的色泽发黄、发绿、发青并且产生黄光，导致肉肠的a*值逐渐下降，b*值逐渐上升[25]。前3 d各处理组的b*值变化差异不显著(P>0.05)，第6天后对照组与其他处理组在各测定时间点b*值变化差异显著(P<0.05)，高浓度LAE组的b*值在第15天时高于低浓度LAE组，说明LAE在一定程度上可以抑制牦牛肉肠b*值的改变，高浓度LAE组与LAE+Nisin组的护色能力相差不大，LAE+CS组的护色效果优于LAE+Nisin组，这可能与壳聚糖的护色效果有关。在15 d贮藏期内，对照组增加的趋势最显著，LAE+Nisin+CS组b*值增加的趋势最缓慢，其护色效果明显优于其他处理组。

2.4 牦牛鲜肉肠贮藏过程中硫代巴比妥酸值(TBA)的变化

在冷藏过程中，随着贮藏时间的延长，牦牛鲜肉肠中脂肪的氧化程度过高，会产生不愉快的气味，影响肉肠的品质及营养价值[26]。随着贮藏时间的延长，牦牛肉肠中不饱和脂肪酸会逐渐氧化形成丙二醛，丙二醛会与硫代巴比妥酸发生反应形成有色物质，测定TBA值可评价贮藏过程中牦牛肉肠的脂肪氧化程度。牦牛肉肠贮藏期间TBA值的变化见图2。

图2 牦牛肉肠贮藏过程中TBA值的变化

由图2可知，整个贮藏期内所有组别的TBA均呈现增加趋势(P<0.05),说明肉肠在贮藏过程中发生了脂肪氧化，且对照组的增加趋势比添加保鲜剂组更显著(P<0.05)，添加保鲜剂可抑制肉肠中脂肪氧化，高含量LAE组的抑制效果强于低含量LAE组，复配组的抑制效果强于单一保鲜的抑制效果。LAE+CS组比的抑制脂肪氧化能力稍强于LAE+Nisin组，可能是壳聚糖具有良好的成膜性，能够选择性抑制O2渗入，使微环境中CO2增多，以达到抗氧化的目的。LAE与Nisin、CS复配使用时效果最显著(P<0.05)。结果表明，3种保鲜剂复配可以协同降低肉肠中微生物对脂肪氧化的作用。

2.5 牦牛鲜肉肠贮藏过程中持水性的变化

持水性是评价肉品品质优劣的重要指标，对肉的颜色、嫩度和多汁性都有着直接的影响。肉品的持水性过低将会导致肉中营养成分，例如游离氨基酸和核苷酸成分流失，降低肉品的营养价值[27]。持水性越高说明牦牛肉肠中的凝胶三维网络结构越致密，束缚水的能力越强。肉肠在贮藏过程中部分蛋白质会水解，造成细胞结构松散，细胞内的水分会向细胞外逐渐扩散，增加汁液流失率，另外，细菌产生的蛋白酶也能加大蛋白的水解程度，随着贮藏时间的延长，肉肠内微生物快速繁殖，加快了细胞破坏速度与蛋白水解速度，使得牦牛鲜肉肠持水性持续下降。牦牛鲜肉肠贮藏期间持水性的变化见图3。

图3 牦牛鲜肉肠贮藏过程中持水性的变化

各处理组的持水性在15 d贮藏期内呈现出显著下降的趋势(P<0.05)，其中对照组的持水性下降最为显著(P<0.05)，其次是低浓度LAE组与高浓度LAE组，再次为LAE+Nisin组与LAE+CS组，而LAE+Nisin+CS组在第15天持水性下降最低，说明3种保鲜剂复配能显著缓减肉肠中水分在外力作用下的流失，结合壳聚糖对畜、禽肉制品的持水力以及抗氧化能力对肉肠品质有较好的改善效果，这与王黎明等的研究结果一致[28]。

3 结论

LAE具有广谱抑菌活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌均有显著的抑制效果，且对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于革兰氏阴性菌。将LAE单独及与天然保鲜剂Nisin和CS复配用于牦牛鲜肉肠的保鲜，最优配方为0.2 g/kg LAE+0.3 g/kg Nisin+5 g/kg CS，在贮藏第15天时其酸价、红度值、亮度值、硫代巴比妥酸分别为0.423 mg/g、10.86 mg/g、39.05 mg/g、0.702 mg/kg，3种保鲜剂复配能较好地保持牦牛鲜肉肠的贮藏品质。通过将LAE与Nisin、CS复配可有效抑制贮藏过程中牦牛鲜肉肠脂肪氧化酸败，保持较好色泽，延长保质期，为牦牛肉制品保鲜技术提供了新思路。