2016-2019年甘肃省小麦叶锈菌群体结构及多样性分析

黄 瑾，张 勃，孙振宇，贾秋珍，曹世勤，骆惠生，王晓明，金社林

(1.甘肃省农业科学院植物保护研究所,甘肃兰州 730070；2.农业部天水作物有害生物野外科学观测实验站,甘肃甘谷 741200；3.农业农村部国家植物保护甘谷观测实验站,甘肃甘谷 741200；4.甘肃省农业科学院小麦研究所,甘肃兰州 730070)

小麦叶锈病是由专性寄生菌引起的影响小麦安全生产的一种重要气传病害，分布广泛，流行性强，危害严重。该病害在美洲、欧洲、非洲、亚洲等的小麦种植区均有发生。全球每年因该病害造成的小麦产量损失达5%～15%，局部地区的减产幅度甚至高达50%。在我国，小麦叶锈病在西南和长江中流域一带发生较重，华北和东北部分麦区也较重。小麦叶锈病曾在1969、1973、1975、1979、2012、2013和2015年在华北地区多次大流行，带来巨大的经济损失。该病害在东北地区1971、1973、1975和1980年中度流行；1990年由于气候条件适宜，其普遍严重发生，造成了小麦大量减产和重大的经济损失。之后，随着小麦抗病基因和抗病品种的利用和更新、栽培制度的改善以及防治措施的改进，小麦叶锈病的发生逐渐减轻。但是近几年来，小麦叶锈病的发生又有回升趋势，田间发病率显著提高，局部地区麦田发生严重，其中在2012年我国甘肃、陕西、湖北、安徽、江苏、河南、山东、河北和内蒙古等地发病严重，全国的发生面积达到217万hm。

种植抗病品种是防治小麦叶锈病最经济、有效的方法。小麦叶锈菌群体毒性的改变是导致小麦抗叶锈品种丧失抗性的主要原因。明确小麦叶锈菌生理小种类型和组成、毒性基因的毒力频率变化及群体遗传结构，可以更好地了解小麦叶锈菌的变异动态，为病害有效预测预报、小麦抗病育种和品种布局调整提供理论依据，以更好地控制该病害。Chen等分析了1992-1996年我国小麦叶锈菌的毒性动态，结果表明，PHT为优势致病类型，、、、、、、、、、8和+为有效抗病基因，不同生态区的小麦叶锈菌群体毒性基因组合及多态性有较大差异。赵盼盼等对 2009-2011年采自河南省的184份小麦叶锈菌菌株进行致病性鉴定及毒性基因频率分析，发现优势小种为THTS、THTT、THKS、PHKT、PHTT、THPS、PHKS、PHSS、THFS、THPN和THSS，、、、、、VB、和对应的抗性基因在河南省几乎完全失去利用价值，部分毒性基因出现频率在年际间变化波动；Zhang等对2014和2015年全国15个省份的小麦叶锈菌进行了毒性分析及鉴定，发现THTT、THTS、THJT、THJS和PHTT为2015年的优势小种类型，其中甘肃省20份小麦叶锈菌菌株划分为13个不同的致病类型，优势小种为THTT。

小麦叶锈菌群体具有明显的毒性多态性和遗传多样性，而且在不同地区存在差异。对2015年云南、四川、青海、陕西、甘肃和河南小麦叶锈菌群体分析发现，云南和四川的毒性多态性最高，青海的毒性多态性最低；河北省小麦叶锈菌群体间有较高的遗传多样性。对2009年采自河北、河南、山东、四川4省的小麦叶锈菌株进行SSR分析表明，河北、河南和山东省的叶锈菌群体遗传多样性水平高于四川群体。本试验以44个近等基因系和已知抗叶锈病基因的品种为鉴别寄主，对2016-2019年度在甘肃省16个县(区)采集的小麦叶锈病标样进行了生理小种鉴定、毒性基因分析和基于毒性的群体结构分析，以期为今后甘肃省小麦叶锈病的抗病育种、品种合理布局以及小麦叶锈病的综合防控提供重要的科学 依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

小麦叶锈菌标样主要采自甘肃省陇南及中部麦区天水市秦州区、甘谷县、清水县，陇南市徽县、礼县，平凉市崆峒区、灵台县、崇信县，庆阳市西峰区、正宁县、镇原县、宁县，临夏州和政县，兰州市榆中县，兰州市会宁县等16个县(区)小麦生产品种、高代品系和抗源材料上，其中天水51份，陇南43份，平凉56份，庆阳59份，定西12份，兰州8份，共231份，采样点涵盖了甘肃省小麦叶锈病发病地区。

16个固定鉴别寄主分别是、、、、、、、、、、、、、、和HUSSAR()；28个辅助鉴别寄主分别为、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、TRANSEC(AWNED)()、PAVON()、C78.5()、98M71()和THATCHER、MANITOU ()、THEW()和GATCHER(++)。它们由华中农业大学兰彩霞教授和河北农业大学李在峰教授提供，感病对照品种铭贤169由甘肃省农业科学院植物保护研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 标样单孢子堆菌株的分离与繁殖

将小麦感病品种铭贤169播种于直径9 cm的花盆内，每盆30～40粒，待小麦第1片叶片展开第2片叶露尖时，先手轻轻摩擦叶片，去掉蜡质层，采用涂抹法接种，再用1 000 ד吐温80”水溶液在小麦叶面上喷雾，使叶片表面附着一层水膜。置于20±5 ℃下黑暗保湿24 h后，移入温度为 15～28 ℃的温室内常规培养；待接种后的麦苗上长出侵染点后，每盆麦苗上只保留1个侵染点，将其余侵染点全部剪掉，然后罩上玻璃罩，以避免菌株之间的混杂。待单侵染点上产生的夏孢子堆成熟时，即获得了单孢子堆菌株。将获得的单孢子堆以同样的接种方法接种于铭贤169上，6～9 d后，收集夏孢子粉，置于4 ℃保存备用。

1.2.2 叶锈菌标样的生理小种鉴定及毒性基因分析

将44个近等基因系、已知小麦抗叶锈病基因的品种及感病对照铭贤169按一定次序播种于花盆内，每盆4个材料，每个材料播种6～8粒，每套鉴别寄主种12盆，各材料间间隔一定距离；待小麦第1片叶片展开、第2片叶露尖时，采用孢子悬浮液喷雾法进行接种；置于20±5 ℃下黑暗保湿24 h后，移入温度为15～28 ℃的温室内培养；接种后10～14 d记载侵染型。侵染型按0、0；、1、2、x、y、z、3、4九个类型划分，侵染型记载和生理小种鉴定均参照中华人民共和国农业行业标准(NY/T1443，1-2007)《小麦抗病虫性评价技术规范：第二部分小麦抗叶锈病评价技术规范对测试材料进行抗性评价》进行。

根据Flor基因对基因理论，对所对应的抗病基因的毒性频率进行分析。

毒力频率=(有毒力菌株/菌株总数)×100%

1.3 数据分析

根据苗期毒性调查结果，将侵染型为0～Z标记为“0”，将侵染型为3～4标记为“1”，在Excel中构建0-1矩阵。

使用Popgene1.32 对“0-1”毒性矩阵进行分析。分析指标包括多态性位点数NP(the number of polymorphic loci)、Nei’s基因多样性指数(Nei’s gene diversity)、Shannon信息指数(Shannon’s information index)、多态性位点百分率(the percentage of polymorphic loci)。计算两两群体间基于Nei’s遗传一致度及遗传距离；根据Nei’s遗传距离，对甘肃省不同麦区小麦叶锈菌群体构建UPGMA(unweighted pairgroup method with arithmetic means)毒性聚类图。

2 结果与分析

2.1 甘肃省小麦叶锈菌的生理小种分析

根据小麦叶锈菌在16个国际通用鉴别寄主上的侵染型，采用北美密码命名系统将2016-2019年采自甘肃的231份小麦叶锈菌标样划分为135个致病类型，主要小种类型为THTP、THTS和THTT，出现频率为5.63%～6.49%；其次为TKTT、NHFF和LHFF等，出现频率为2.60%～3.46%；PHTT、THKT、NHFP、NHKP等22个小种类型出现频率为0.87%～2.16%；其余107个小麦叶锈菌标样分别归类为107个不同的致病类型。2016年监测优势小种为THTP、THTS、THTT和TKTT；2017年THTS、THTT和TKTT出现频率下降，优势生理小种为THTP；2018-2019年THTP出现频率下降，2018年优势小种类型为NHFP，2019年优势小种类型为NHFF和LHFF。甘肃省叶锈菌群体结构较复杂且年度间存在差异。

表1 2016-2019年甘肃省小麦叶锈菌主要致病类型及其出现频率Table 1 Main pathogenic types and frequency of Puccinia triticina in Gansu Province from 2016 to 2019

2.2 甘肃省小麦叶锈菌毒性基因分析

2016-2019年对甘肃省小麦叶锈菌毒性频率进行分析，结果(表2)表明，、、、、、、、、、、、、、、、、和的出现频率在80%以上，说明甘肃省小麦叶锈菌群体绝大多数携带这些毒性基因，与这些毒性基因所对应的抗性基因、、、、、、、、、、、、、、、、和抗性已经丧失，说明这些抗叶锈基因为无效基因，在抗病育种中已经失去了利用价值；其中、、、、、、、、和的毒性频率超过了95%，表明其对应的抗病基因、、、、、、、、和几乎完全丧失了抗性。毒性基因、、、、、、、、、、、和的出现频率介于30%～80%，表明其对应的抗病基因、、、、、、、、、、、和仍有一定的使用价值，但单独使用价值不高，可考虑与其他抗叶锈基因组合应用；毒性基因、、、、、++、、、、、、和的出现频率低于30%，其中、、、、、和的出现频率在15%以下，所对应的抗叶锈基因、、、、、和为目前甘肃省最有效的抗叶锈病基因，在抗病育种中具有较好的利用价值。其中，、、、、、、、、、、、和的出现频率在年度间差异变化较大。、、、、和在2016-2019年的出现频率呈逐年下降趋势，2016年的出现频率为 68.93%～91.35%，2019年下降为8.49%～ 30.98%；、和在2016年的出现频率分别为3.00%、6.41%和33.66%，在2019年分别上升为83.05%、100%%和70.21%；在2016年的出现频率为95.19%，2019年下降为41.38%；的出现频率呈逐年下降趋势，由2016年的48.08%降为2019年的5.08%；、和出现频率在年度间有变化波动。

表2 2016-2019年甘肃省小麦叶锈菌毒性基因频率分析Table 2 Virulence frequency of Puccinia triticina to wheat leaf rust resistance genes in Gansu Province from 2016 to 2019

2.4 基于毒性的遗传多样性分析

2.4.1 毒性多样性分析

假定群体处于Hardy-Weinberg平衡条件下利用POPGENE 1.32软件对231份小麦叶锈菌(其中天水51份、陇南43份、平凉56份、庆阳59份、定西12份和兰州8份)进行群体遗传多样性参数分析。结果表明，在物种水平上，观察等位基因数(Na)为1.90，有效等位基因数(Ne)为 0.259 6，Nei’s基因多样性指数()为0.104 6，Shannon信息指数()为4.281 5，多态位点百分率()为100%，表明甘肃省内小麦叶锈菌遗传多样性丰富。在群体水平上，观察等位基因数(Na)为1.604 7～1.931 8，平均为1.810 0，有效等位基因数(Ne)为1.366 0～1.561 5，平均为 1.439 7，多态位点百分率()为59.09%～ 97.73%，平均为80.30%。天水、陇南、平凉、庆阳、定西和兰州的Nei’s基因多样性指数()分别为0.278 9、0.248 4、0.279 8、0.328 8、0.225 5和0.211 4，Shannon信息指数()分别为0.429 7、0.384 3、0.426 1、0.492 2、0.333 6和0.315 9，表明平凉、庆阳、天水和陇南的群体遗传多样性水平高于定西和兰州群体。

表3 小麦叶锈菌的群体遗传多样性Table 3 Population genetic diversity of Puccinia triticina to wheat leaf rust

2.4.2 毒性的遗传一致度和遗传距离分析

利用POPGENE 1.32计算了Nei’s的遗传距离和遗传相似度系数，群体间的遗传距离为 0.006 4～0.155 6，遗传相似度系数为0.855 4～ 0.993 7，表明群体间的亲缘关系较近，其中平凉和庆阳两个群体间的遗传相似度较高，其遗传相似系数为0.993 7，而平凉和定西的两个群体间的遗传相似度相对最低，其遗传相似系数为 0.855 9，说明叶锈菌群体间的亲缘关系与地理分布具有一定的相关性。

2.4.3 毒性的群体聚类分析

基于毒性的Nei’s遗传一致度用NTSYS 2.10e软件做的UPGMA聚类图表明，在相似系数为0.940 0处，将小麦叶锈菌的6个群体聚为三个大的类群，类群1由平凉和庆阳菌株组成，类群2由天水和陇南菌株组成，类群3由定西和兰州菌株组成；在相似系数为0.90处，将小麦叶锈菌的6个群体聚为两个大的类群，类群1由天水、陇南、平凉和庆阳菌株组成，类群2由定西和兰州菌株组成。由聚类结果得知，平凉和庆阳的叶锈菌亲缘关系最近，天水和陇南的叶锈菌亲缘关系最近，定西和兰州的叶锈菌亲缘关系最近，其中陇东地区(平凉和庆阳)和陇南地区(天水和陇南)亲缘关系最近，和中部地区(定西和兰州)亲缘关系较远。这说明平凉和庆阳的毒性遗传距离最近，天水和陇南的毒性遗传距离最近，定西和兰州的毒性遗传距离最近，定西和兰州与平凉和庆阳群体的毒性遗传距离最远。

表4 群体间的Nei’s遗传距离和遗传相似度Table 4 Nei’s genetic distances and genetic similarity coefficients among different geographical groups of Puccinia triticina

TS：天水；LN：陇南；PL：平凉；QY：庆阳；DX：定西；LZ：兰州。

3 讨 论

小麦锈菌的毒性变化曾导致我国先后数批小麦品种丧失抗性，并造成小麦锈病的大流行。开展小麦叶锈菌生理小种(致病类型)鉴定和系统监测、查明小麦叶锈菌生理小种的类型、组成和致病特点，是做好小麦抗病育种和品种布局调整的基础，目的是为了有效地预测预报和监测该病害的发生发展情况，为更好地控制该病害提供依据。本试验对2016-2019年甘肃省不同地区采集的231份标样利用16个固定鉴别寄主进行了生理小种鉴定，2016年监测优势小种为THTP、THTS、THTT和TKTT；2017年THTS、THTT和TKTT的出现频率下降，优势生理小种为THTP；2018年优势小种类型为NHFP；2019年优势小种类型为NHFF和LHFF。四年间甘肃省出现频率较高的小种类型为THTP、THTT和THTS，其次为TKTT、NHFF和LHFF。与全国其他省份主要小种类型相比，THTT和THTS是与全国共有的优势小种类型，THTP、TKTT、NHFF和LHFF是不同于全国其他省份而出现的甘肃省特有的优势小种类型，其中THTP在2009年四川小麦叶锈菌监测中出现，TKTT、NHFF和LHFF在全国其他省份中未见相关报道；较之全国其他省份，甘肃省小种呈现类型多的特点，且优势小种频率相对较低，甘肃省生理小种出现的类型、优势生理小种的种类与其他省份存在地区间差异，甘肃省年度间小种类型结构也存在差异，可能因为不同麦区的抗锈基因品种的种植、气候条件及当地选择效应的差异造成的，这与Kolmer、赵盼盼等、Kolmer、Liu and Chen、Zhang等的研究结果一致。

小麦叶锈菌毒性基因频率的变化与叶锈菌自身群体毒性基因结构的进化发展、小麦品种以及年度 间叶锈菌标样来源有关。调查发现，2007年，陕西、湖北和四川小麦叶锈菌中毒性基因、、、、、、、、和的频率均小于21%，、和的毒性频率均为0；2014-2015年包括甘肃在内的15个省叶锈菌对、、、、、、、、、、、、、+、和的毒性频率超过90%，对、、、、、、、、、和的毒性频率低于30%，没有发现对和8有毒性的菌株。本试验中供试菌系对、、、、、、、、、、、、、、、、和的毒性频率高于80%，这些基因在甘肃省的抗病育种中已经失去了利用价值；对、、、、、和的毒性频率低于15%，这些基因为目前最有效抗病基因。其中和的出现频率分别为 4.46%和15.27%，但陇南、定西和兰州小麦叶锈菌供试菌株对和的毒性频率均为0；的出现频率为27.60%，但陇南、定西和兰州小麦叶锈菌供试菌株对的毒性频率分别为 76.47%、87.50%和80.00%。因此，年度间叶锈菌对部分基因的毒性频率变化波动较大，推断可能是不同地区种植了不同类型的抗性基因背景的小麦品种以及不同年份叶锈病标样主要采集地点不同等原因造成了年度间小麦叶锈菌的毒性差异。2019年由于种子量缺失，仅有1份出苗且表现为感病，导致样本数量偏少，的出现频率从2016-2018年的6.41%、0、10.53%上升到2019年100%。目前，我国小麦材料中仅含、、和等少数几个抗病基因，而、、、、和等抗病基因在生产品种中尚未广泛应用，因此有必要对甘肃省主要小麦品种进行抗锈基因分析，明确小麦抗叶锈基因在甘肃省的分布情况，为小麦品种的合理布局和抗叶锈病综合防治提供可靠依据。

在小麦叶锈菌群体毒性多态性方面，Shannon多样性指数代表了毒性基因组合的丰富度，毒性基因组合越多，分布越均匀，则多样性值越高，Nei’s基因多样性指数代表的是群体对抗病基因有毒和无毒的杂合性。本研究对甘肃省天水、陇南、平凉、庆阳、定西和兰州小麦叶锈菌群体进行了基于毒性的多样性分析，发现平凉、庆阳、天水和陇南群体的多态性位点百分率较高，定西和兰州群体的多态性位点百分率较低。从Shannon多样性指数和Nei’s基因多样性指数综合来看，平凉、庆阳、天水和陇南的群体遗传多样性水平高于定西和兰州群体，聚类分析表明陇东地区(平凉和庆阳)和陇南地区(天水和陇南)亲缘关系最近，和中部地区(定西和兰州)亲缘关系较远。从地域分布上，平凉与庆阳邻近，定西和兰州邻近，天水与平凉、定西和陇南邻近；在种植方式上，天水、陇南、平凉和庆阳属于冬小麦种植区，定西和兰州为春小麦和冬小麦混合种植区；从病害发生情况看，以2018年为例，6月13日对甘肃天水、陇南等地的小麦叶锈病发生情况进行了调查，发生程度为3/40/20(反应型/严重度/普遍率)；7月6日，对定西小麦叶锈病的发生情况进行了调查，发病程度为3/40/40；7月7日，兰州小麦叶锈病发生程度为3/5/1，平凉、庆阳、天水和陇南的发病时间略早于定西和兰州地区。推测地域分布、小麦种植方式、小麦叶锈菌初始菌源和传播以及品种抗性基因多样性等都是小麦叶锈菌群体毒性多样性的影响因素，在今后的生产中应加强病害调查及毒性变异监测工作。

近年来，随着全球气候的变暖，气象条件更加适合小麦叶锈病的发生和流行。由于缺乏有效的抗病品种，适宜气候条件将极易造成小麦叶锈病的严重发生。本研究对甘肃省小麦叶锈菌生理小种、毒性基因进行分析，明确了生理小种类型及群体毒性特点，今后应继续加强对小麦叶锈菌致病类型监测研究，掌握甘肃省小麦叶锈菌群体毒性变异动态；同时进一步研究栽培品种抗叶锈基因背景，进行病害适宜发病环境因子影响研究，揭示叶锈病在甘肃省上升流行的原因，这将为甘肃省小麦叶锈病抗病品种选育工作具有重要意义，同时为今后小麦叶锈病发生与流行、预测预报及有效防治提供科学依据。