高效液相色谱法测定食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素以及香豆素的研究

管淑霞，林新传，都 颖

（食品药品检验检测研究院，山东威海 264400）

香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素都具有香荚兰豆香气及浓郁的奶香，其中乙基香兰素香气更是香兰素的3 ～4 倍，且留香持久[1]。这几种香料用途广泛，主要起增香和定香作用，广泛用于食品、日用化妆品、烟草等行业[2]。香豆素一般存在于黑香豆、香蛇鞭菊、野香荚兰和兰花中，具有新鲜干草香和香豆香，但一般不作食用，允许烟用和外用。据欧盟专家委员会2000 年2 月24 日报道，人体大量摄入香兰素等食品添加剂可导致头痛、恶心、呕吐和呼吸困难等症状，严重的可能会损伤肝、肾[3]。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中允许使用的食品用合成香料名单有1 477种，其中包括香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素，食品分类中约有28 种食品没有加香的必要，不得添加食品用香料、香精。标准中也明确规定了较大婴儿和幼儿配方食品中可使用香兰素、乙基香兰素，最大使用量均为5 mg/100 mL；婴幼儿谷类辅助食品中可使用香兰素，最大使用量为7 mg/100 g，其中100 g和100 mL 都以即食食品计，是生产企业按照冲调比例折算成食品中的使用量；而使用范围涵盖0 ～6个月婴幼儿配方食品不得添加任何食品用香料[4]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

婴幼儿配方乳粉、牛奶糖、饮料，均购自本地超市；香兰素标准品（C8H8O3，CAS 号121-33-5，天津阿尔塔科技有限公司，编号S087267，100 μg/mL）；甲基香兰素标准品（C9H10O3，CAS 号120-14-9，天津阿尔塔科技有限公司，编号S078875，100 μg/mL）；乙基香兰素标准品（C9H10O3，CAS 号121-32-4，天津阿尔塔科技有限公司，编号S086815，100 μg/mL）；香豆素标准品（C9H6O2，CAS 号91-64-5，天津阿尔塔科技有限公司，编号S077371，100 μg/mL）；甲醇；乙腈（色谱纯）；有机系微孔滤膜（孔径0.45 μm，天津市津腾实验设备有限公司）。

1.2 仪器与设备

1260 高效液相色谱仪（带二极管阵列检测器），Agilent；QUINTIX224-1CN电子天平，德国赛多利斯；V4DS025 涡旋混合器，德国艾卡；G-16C 高速冷冻离心机，德国赛多利斯；氮气浓缩装置；超声波发生器。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

（1）甲醇-水溶液（4+1）。将甲醇400 mL 和水100 mL 混合均匀。

（2）盐酸溶液（1 mol/L）。吸取8.33 mL 浓盐酸，定容至100 mL 水中，临用现配。

1.3.2 试样制备及测定

将牛奶糖粉碎，饮料摇匀备用，乳粉直接用于试样提取。称取1.00 g 试样，婴幼儿配方乳粉加入10 mL 水和480 μL 盐酸溶液，糖果及饮料加入5 mL水，溶解，涡旋振荡1 min，加入乙腈20 mL，涡旋振荡1 min，超声提取30 min 后，加入氯化钠5 g，涡旋振荡2 min，8 000 r/min，离心5 min，将上清液转移至玻璃试管，40 ℃氮吹至近干，准确加入1.0 mL 甲醇-水溶液溶解残渣，过0.45 μm 微孔滤膜后，待测[5]。

将试样溶液注入高效液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到试样溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的浓度。

1.3.3 标准品的配制

吸取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素 标 准 液（100 μg/mL）各1 mL 混 合成25 μg/mL 的溶液，-18 ℃避光保存，保存期3 个月。分别吸取适量25 μg/mL 混合标准储备液8 μL、40 μL、200 μL、400 μL 和1 000 μL，用甲醇-水溶液定容至1 mL，配成浓度为0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL 和25.0 μg/mL 标准工作液。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5μm；柱温：30 ℃；检测波长：279 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；流动相：A 相为0.5%甲酸溶液，B 相为乙腈；梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱表

2 结果与分析

2.1 线性范围及检出限

在1.3.4 色谱条件下，对标准工作曲线进行测定，得到4 种化合物的线性范围、线性相关系数及回归方程，在3 倍信噪比的进样浓度水平下计算检出限。在0.2 ～25.0 μg/mL，香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的峰面积均与浓度线性关系良好，相关系数均大于0.999 9，检出限为0.05 ～0.07 mg/kg，结果如表2 所示。

表2 4 种化合物的线性范围、线性方程、相关系数及检出限

2.2 加标实验

以不含香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的奶粉为空白样品基质，分别计算0.1 mg/kg、0.2 mg/kg 和0.3 mg/kg 3 个加标水平下4 种化合物的回收率。4 种化合物的加标回收率为96.1%～108.7%，结果如表3 所示。

表3 4 种化合物的加标实验结果

2.3 精密度实验

用样品加入0.1 mg/kg 混合标准液连续进样6 次进行检测，得出精密度为1.27%～3.00%，结果如表4 所示。

表4 4 种化合物的精密度实验结果

2.4 食品检测结果

对市售的几种婴幼儿乳粉、牛奶糖、饮料进行检测，结果如表5 所示。除婴幼儿配方乳粉、酸奶外，其他几款食品都在配料上标注添加了食用香精。通过表5 能看出部分食品都不同程度地检测出了香兰素与乙基香兰素，由于未设定限量，各类食品添加量也不同，往往奶香味越足的食品香精含量也越高。

表5 市售食品4 种香精的检测结果（单位：mg/kg）

3 结论与讨论

有研究表明，香兰素、乙基香兰素的少量摄入对人体没有危害，但对于6 个月以内的婴幼儿来说，可能会破坏他们的食欲。婴幼儿的身体器官未发育成熟，代谢排毒能力较差，摄入含有食品添加剂的食物会加重其日常代谢的负担。过多摄入，还可能会造成偏食、厌食、挑食等问题，养成不良的饮食习惯。市售的多种奶味饮品、糖果均检测出香兰素，两款饮品检测出乙基香兰素，因此要注意不要过早给婴幼儿食用各种饮品。本文参照GB 5009.284—2021采用高效液相色谱法测定食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素，标准曲线线性关系良好、方法的检出限及回收率符合相关标准的要求，能满足实验室对食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素以及香豆素的检测要求，可以为有关市场监管部门加强婴幼儿乳粉中香精检测提供技术支持。