8种中草药材提取物体外抗人肺炎支原体活性研究

柴 琳，张 俊，李 萌，赵若莲，刘荣均，李云芬

（云南中医药大学第三附属医院，云南 昆明 650011）

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是一种主要引起上、下呼吸道感染的病原体［1-2］，可以导致呼吸道感染、支气管炎、哮喘、不典型肺炎等一系列疾病。本病原体常感染学龄儿童及老年人，约占呼吸道感染疾病的20%。目前，治疗肺炎支原体肺炎（MPP）的首选药物是大环内酯类抗生素，随着临床MP耐药菌株的不断增加，使临床治疗效果降低。由于中药的特殊性，细菌较少对其产生耐药，本研究拟根据8种中药对肺炎支原体的体外抑菌试验，筛选出对肺炎支原体有较好抑菌和杀菌效果的中草药材，为中药院内制剂开发和中医临床用药提供实验及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

中草药：云南石斛（dendrobium）、辽宁板蓝根（radix isatidis）、云南臭灵丹（Laggera pterodonta）、甘肃半夏（pinellia ternate）、四川鱼腥草（herba houttuyniae）、河北黄芩（radix scutellariae）、安徽桔梗（Platycodon grandiflorum）、河南艾叶（folium artemisiae argyi）。

实验菌株：肺炎支原体2株流行株ATCC15531、ATCC29342和4株耐药株MP8、MP10、MP19、MP47（均来源于昆明医学生物学研究所）。

培养基：PPLO液体培养基。

实验设备：贝克曼离心机、山东新华电热蒸汽压力灭菌器、力康电热恒温培养箱。

1.2 方法

中药原液制备：中药原液的制备采用二次煮沸法。称取8种中药100g，加入蒸馏水300mL浸泡20min，强火加热煮沸，文火煎煮30min，搅拌，过滤；药渣再加入蒸馏水150mL按上法煎熬、过滤；两次药液合并浓缩成100mL，用NaOH调pH值至7.6～7.8，取50mL作为未离心药液备用，剩余50mL置离心管中4000r/min离心10min；121℃高压蒸汽灭菌20min后，作为中药原液（1mL药液相当于原药材1g），存放4℃冰箱贮存备用。实验前以MP液体培养基稀释。

中药液的稀释：采用倍比稀释法，对离心和未离心药液进行相同处理。（1）取中药原液125µL加入液体培养基875µL配为125.00mg/mL药液①；（2）取药液①250µL加入液体培养基750µL配为62.50mg/mL药液②；（3）取药液②250µL加入液体培养基750µL配为31.25mg/mL药液③；（4）取药液③250µL加入液体培养基750µL配为15.63mg/mL药液④；（5）取药液④250µL加入液体培养基750µL配为7.81mg/mL药液⑤；（6）取药液⑤250µL加入液体培养基750µL配为3.91mg/mL药液。

肺炎支原体菌株的复苏培养：ATCC15531、ATCC29342、MP8、MP10、MP19、MP47的冻干菌株（昆明医学生物学研究所保藏）接入PPLO液体培养基中，37℃培养1周。培养基由红变黄，再次转接到PPLO液体培养基中，37℃培养5天，即为MP-2（第2代）。

MP工作菌液的制备：将冻干保存的肺炎支原体菌种，用PPLO液体培养法连续传代，取第3代，采用颜色变化单位（ colour change units，CCU）方法测定MP浓度，用MP液体培养基稀释到104～ 105CCU /mL，作为工作菌液。

最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）测定：采用微量稀释法测定其最低抑菌浓度（MIC值）。在12×8孔聚苯乙烯微量板上试验：第1孔加入100μL培养基和100μL工作菌液作为阳性对照。从2～11孔分别加入100μL稀释药液和100μL工作菌液，每个浓度做3个，第12孔加入200μL培养基，为阴性对照；药物浓度从第2孔开始依次为125.00mg/mL、62.50mg/mL、31.25mg/mL、15.63mg/mL、7.81mg/mL、3.91mg/mL；同时，做每个药液浓度加培养基的对照，排除药液的颜色干扰；滴入无菌液体石蜡密封，盖上板盖，轻摇混匀，用封口膜封边，置电热恒温培养箱内37℃孵育48h～96h后观察结果。利用MP的生长代谢产物，可以改变培养液的pH值，从而引起其中指示剂变色的特点，来判定MP的生长状况，即阳性对照孔发生颜色改变（即培养液中酚红指示剂由红色变为橘黄色）且无混浊，加药孔不再出现颜色变化的最小药物浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。

2 结 果

2.1 最小抑菌浓度MIC

采用微量稀释法测得8种中草药提取物体外抗肺炎支原体MIC结果，结果如表1所示。从实验结果可以看出，所选的7种中草药粗提药液以及药液的浓度对2株ATCC15531、ATCC29342肺炎支原体流行株有一定的抑制作用：艾叶、桔梗、黄芩、臭灵丹和板蓝根对MP的抑制作用最强，MIC均为3.91mg/mL；鱼腥草次之为15.63mg/mL；石斛作用最弱为62.50mg/mL；而半夏对MP无抑制作用。与此相似，对4株肺炎支原体耐药株，艾叶、桔梗、黄芩、臭灵丹和板蓝根的抑制作用最强MIC均为15.70mg/mL；鱼腥草次之为31.30mg/mL；石斛作用最弱为125.00mg/mL。因此8种中药对MP流行株和耐药株的抑制顺序相同，依次为：艾叶、桔梗、黄芩、臭灵丹、板蓝根抑制作用最强，鱼腥草次之，石斛抑制作用较弱，半夏无抑制作用。

表1 8种中草药材提取物体外抗肺炎支原体2株流行株MIC结果 （mg.mL-1）

表2 8种中草药材提取物体外抗肺炎支原体4株耐药株MIC结果 （mg.mL-1）

2.2 8种中草药材提取物抗4种肺炎支原体耐药株实验结果图片（备注：因篇幅原因，3.91mg/mL浓度未列出）

3 讨 论

肺炎支原体（MP）是呼吸道感染的常见病原，数据显示，MP是5～15岁儿童社区获得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）和老年人支气管肺炎的常见病原菌，占10%～40%［3-4］，仅次于肺炎链球菌，且有逐年升高的趋势。除此之外，它还与急性和慢性呼吸道疾病有关，大约有25%～30%的MP感染会引发肺外并发症［5］。MP的感染通常间隔3～7年会发生地方性流行和大流行［6-8］。

MP缺乏细胞壁这一结构特点，故对作用于细胞壁的抗生素如青霉素类、头孢菌素类不敏感，而对影响蛋白质和DNA合成的抗生素如大环内酯类、四环素类、喹诺酮类等敏感。总体来说，由于四环素类和喹诺酮类抗生素存在潜在的严重不良反应，所以MP感染的治疗仍以大环内酯类药物为主，但近些年来，随着大环内酯类药物在临床上的广泛应用，临床遇到越来越多的大环内酯类抗生素治疗无效的病例［9］，并分离出耐药菌株［10］，提示MP耐药现象的存在。目前，国内外MP耐药现象严重，在世界范围内呈上升趋势。据最近几年资料显示，MP对大环内酯类耐药率在日本为30.6%［11］，法国为9.8%［12］，德国为3.0%［13］，美国为27%［14］，我国陈岳明等［15］报道2009年杭州市MP耐药率达到78.9%，辛德莉等［16］报道2009年北京地区耐药率已达92%，刘杨等［17］报道2009年上海MP耐药率为83.0%，韩晓华等［18］报道沈阳地区MP耐药率达到100%。由此可见，我们国内各地区MP耐大环内酯类非常严重。这对肺炎支原体感染导致的肺炎及肺外并发症的治疗产生了极大的挑战，虽然目前对肺炎支原体耐药菌株的监测已经被纳入美国感染性疾病协会指南以及欧洲呼吸协会指南等，但目前尚无详细的关于针对肺炎支原体耐药菌株的治疗方案。

由于中药的特殊性，细菌不易对其产生耐药，且其具有来源广，价格低，毒性较低等优点，在防病抗病毒的同时还能提高机体的免疫力，增强机体整体的抗病抗菌能力，从而在MP治疗方面渐显优势。据郑青山教授统计研究结果表明，芩柏清肺浓缩丸（主要成分为黄芩，桔梗等）治疗支原体肺炎总疗效优于阿奇霉素颗粒，与阿奇霉素比较，起效快，改善症状明显［19］。桔梗皂苷D是芩柏清肺丸（芩柏）的重要成分，通过桔梗皂苷D治疗肺炎支原体感染的细胞和小鼠，可以使细胞生长加快，同时强烈抑制肺炎支原体P1和P30蛋白的表达，从而抑制肺炎支原体，已被批准为首批有效抗MP的中药［20-21］。

在对前期中药治疗耐药性和顽固性支原体肺炎疗效回顾性分析时，发现院内制剂复方臭灵丹合剂、清炎合剂、镇咳神口服液在治疗耐药性MPP上有较好的疗效。结合此3种制剂主要成分和临床用中药治疗耐药MPP的有效处方方剂，选出本研究用的8种单味中草药材：臭灵丹、黄芩、鱼腥草、南板蓝根、桔梗、石斛、半夏、生艾叶；其中石斛、半夏为云南道地特色药材。这8种药材具有清热解毒、润肺止咳［22］、止咳化痰［23］、抗菌消炎［24］的功效。实验所选的8种中草药粗提药液以及药液的浓度对2株ATCC15531、ATCC29342肺炎支原体流行株有一定的抑制作用。从实验结果可以看出，艾叶、桔梗、黄芩、臭灵丹和板蓝根对MP的MIC均为3.91mg/mL；鱼腥草为15.63mg/mL；石斛为62.5mg/mL；而半夏对MP无抑制作用。对4株肺炎支原体耐药株，艾叶、桔梗、黄芩、臭灵丹和板蓝根对MP的MIC均为15.7mg/mL，鱼腥草为31.3mg/mL，石斛为125mg/mL，半夏对MP无抑制作用。8种中草药对MP流行株和耐药株的抑制顺序相同，依次为：艾叶、桔梗、黄芩、臭灵丹、板蓝根抑制作用最强，鱼腥草次之，石斛抑制作用较弱，半夏无抑制作用。4株耐药MP的MIC明显高于流行标准株。8种中草药粗提药液经离心和不离心处理，离心后的药液对MP的抑制效果有所减弱，尤其是臭灵丹为62.5mg/mL。8种中草药提取物体外抗人肺炎支原体不离心效果较离心效果好。

目前越来越多的国内外学者开始尝试从传统中医药中寻找解决细菌耐药问题的新思路。本研究立足于中药材，结果表明艾叶、桔梗、黄芩、臭灵丹、板蓝根能较好的抑制肺炎支原体流行株及耐药株，为相关中成药及院内制剂的研发提供实验及理论依据。下一步可进一步探讨中药材抑制肺炎支原体的作用机制，以充分发挥检验医学在中西医结合中的桥梁作用，从而促进中西医结合事业的发展。