miR-106b-25基因簇在肝泡型包虫病肝组织中的表达及意义

马福财，杨德武，王 铮，盖志刚，朱海宏

泡型包虫病(Alveolar echinococcosis，AE)是一种罕见的、严重的人兽共患寄生虫疾病，是由多房棘球绦虫的幼虫(泡球蚴)在中间宿主肝内不断增殖而引起的一种严重肝病，常被误诊为肝癌[1]。棘球绦虫的感染过程如下：中间宿主通过摄入终末宿主的粪便中的虫卵感染, 虫卵在中间宿主体内孵化为幼虫，幼虫会因为终末宿主捕食已感染的中间宿主而寄生于其肠道内发育成虫。成虫的卵随粪便排出又感染中间宿主，形成循环感染[2]。食肉动物是棘球绦虫的终宿主，摄取卵后，这些卵在人类肠道中孵化释放通过门静脉和淋巴管到达肝脏，发育成为幼虫，它们也可能到达肺、脑、骨骼或者其他器官，但相比于肝脏，其他部位发生的频率很低[3]，因此肝脏是泡球蚴感染寄生的主要靶器官。泡球蚴进入肝脏形成原发病灶后就开始对肝脏进行持续性不可逆的损伤，最终导致局部肝纤维化[4]。肝脏泡型包虫病病灶成缓慢浸润性生长，类似缓慢生长的肝癌，不断产生新囊泡而侵犯邻近组织结构，最终导致肝功能障碍[5]。

miRNAs(microRNAs，微小RNA)，是一类长度在21～22个核苷酸的小RNA分子，其主要特点是内源性单链非编码的单链小分子RNA，能够通过与靶mRNAs特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调控[6]。大量的研究已经表明miRNAs失调与许多人类疾病有关，如癌症、自身免疫性疾病和寄生虫病[7-9]。在各种急慢性肝损伤的进程中，miRNAs通过调节不同的靶基因产生重要的作用[10]。在泡球蚴感染寄主的过程中，miRNAs也起着至关重要的作用[11]。miRNAs基因簇是由部分miRNAs基因紧密相连，排列成簇地分布在同一区域发挥功能。基因簇的功能往往比单独的基因作用更加高效，基因簇的多个成员之间同时作用相互协同，能够更加高效的发挥生物学功能。miR-106b-25基因簇的转录本定位于人类7号染色体上，这个区域编码了3种成熟的miRNAs即miR-106b，miR-93和miR-25。本文对miR-106b-25基因簇在肝泡型包虫病肝组织中的表达进行了初步研究，以期能为肝泡型包虫病的临床诊疗和研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2020年7月至2020年10月青海省人民医院确诊的20例泡型肝包虫病患者，均为来自青海藏区的藏族患者，男11例，女9例，年龄20～50岁。纳入标准：1)术前血清学包虫抗体阳性， 肝脏三期CT及术后病理均诊断为肝泡球蚴病；2)首次行肝泡球蚴病灶根治术；3)术前未发现远处脏器转移；4)未合并肝囊性包虫病及其它原因占位性疾病(寄生虫、良恶性肿瘤、肝脓肿等)；5)无肝炎、黄疸等慢性肝功能受损史；6)无上腹部尤其是肝胆系统手术史及介入治疗史。本研究经青海省人民医院伦理审查委员会同意，研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器 miRcute miRNA提取分离试剂盒(离心柱型，目录号DP501)、miRcute增强型miRNAcDNA第1链合成试剂盒(目录号：KR211)、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBRGreen目录号：FP411)和内参U6均购自于天根生化科技有限公司(北京)，PCR引物由北京六合华大基因科技有限公司合成(表1)，石蜡切片机RM2125RT(德国 LEICA)，BX53光学显微镜(日本 OLYMPUS)，罗氏LC480Ⅱ实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，USA)，超微量核酸蛋白测定仪(德国 Implen NP80 Mobile)，常规试剂、普通及预冷离心机、冰箱等由青海大学国家三江源重点实验室提供。

1.3 病理检查 根据病例取材，每个患者的肝脏标本分为病灶旁肝组织(距病灶2 cm内)、正常肝组织(距病灶2 cm以外正常组织)。肝脏组织样本经10%甲醛固定、石蜡包埋、切片(2片)后，分别行HE染色和Masson染色。由资深病理科专家读片，依据肝纤维化半定量评分系统进行肝纤维化分级[12]。F0：无明显肝纤维化；F1：汇管区有纤维化，但无纤维间隔，属轻度纤维化；F2：汇管区有纤维化伴少量纤维间隔分隔，属中度纤维化；F3：有大量间隔纤维化但无肝硬化，属重度纤维化；F4：肝硬化。

1.4 实时荧光定量PCR 将20例新鲜标本取出后速冻于液氮移送至实验室。液氮中取出标本组织，将组织剪碎在液氮中磨碎，每30～50 mg组织中加入1 mL裂解液MZ，用匀浆仪进行匀浆处理。将上述组织按照miRcute miRNA提取分离试剂盒说明书进行，用氯仿、无水乙醇等试剂进行miRNA的提取。RNA定量检测使用超微量核酸蛋白测定仪进行，纯度及完整性采用甲醛变性凝胶电泳实验进行检验。

按照miRcute增强型miRNAcDNA第一链合成试剂盒的说明进行加尾法逆转录，将反应后合成的20 μL cDNA装于EP管中置于-20 ℃保存，以备进行下游荧光定量检测。miRNA前引物见表1，后引物为试剂盒中的通用引物。反应体系：2 μL的cDNA模板，0.4 μL前引物和0.4 μL后引物， 10 μL的2×miRcute plus miRNA Premix，7.2 μL双蒸水。罗氏LC480Ⅱ实时荧光定量PCR仪上设置反应条件为：预变性95 ℃反应15 min，两步循环包括“94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s”，共40个循环，U6 RNA作为内参，反应条件同上，实验重复3次，取平均值。所得数据运用RQ=2-ΔΔCT计算，(Ct值为荧光达到阈值时所需要的PCR循环数)，测定miRNA的相对表达量[13]。

2 结 果

2.1 泡型包虫病肝纤维化病理观察

2.1.1 HE染色 病灶旁肝组织HE染色，肝小叶结构有不同程度破坏、可见不同程度肝细胞变性、萎缩、坏死及纤维组织增生，可见嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞浸润(图1)。正常肝组织HE染色后，肝脏无异常病理改变；肝小叶结构清晰，无变性、坏死及炎性细胞浸润；肝细胞大小均匀、形态正常。

0级 1级 2级 3级注：*为病灶周围出现炎症反应，包括嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、纤维组织增生等图1 肝组织HE染色病理结果(200×)Fig.1 Pathological results of HE staining of liver tissue (200×)

2.1.2 Masson染色 病灶旁肝组织染色后可见汇管区较多纤维结缔组织增生，出现不同程度小叶内纤维化；部分病灶旁肝组织染色后可见汇管区大量纤维结缔组织增生，小叶内大量纤维化(图2)；正常肝组织染色后无明显异常病理改变。40例肝泡型包虫病患者肝组织标本中，病灶旁肝组织中存在9例1级纤维化、6例2级纤维化和5例3级纤维化；正常组无纤维化，均为0级。

0级 1级 2级 3级图2 肝组织Masson染色病理结果(200×)Fig.2 Pathological results of Masson staining of liver tissue (200×)

2.2 miR-106b-25基因簇在肝组织中的表达水平

经荧光定量RT-PCR检测结果发现，miR-106b、miR-93和miR-25在病灶旁肝组织中的相对表达量均高于正常肝组织，差异具有统计学意义(P<0.0001)。见表2及图3。

表2 病灶旁肝组织和正常肝组织中miR-106b、miR-93和miR-25的相对表达量(n=20)Tab.2 Expression of miR-106b, miR-93 and miR-25 in para-lesion and normal hepatic tissues (n=20)

注：①P<0.001图3 病灶旁肝组织和正常肝组织中miR-106b、miR-93和miR-25的表达量(n=20)Fig.3 Expression of miR-106b, miR-93 and miR-25 in para-lesion and normal hepatic tissues (n=20)

2.3 miR-106b-25基因簇与肝纤维化程度分析

2.3.1 miR-106b-25基因簇与肝纤维化程度的相关性 采用Spearman相关判断miR-106b-25基因簇与肝纤维化程度的相关性，结果显示miR-106b(r=0.806,P<0.001)、miR-93(r=0.799,P<0.001)和miR-25(r=0.789,P<0.001)均与肝纤维化程度存在正相关。见图4。

图4 miR-106b-25基因簇与肝纤维化程度相关性分析Fig.4 Correlation analysis of miR-106b-25 gene cluster and hepatic fibrosis degree

2.3.2 肝纤维化程度与miR-106b-25基因簇表达水平的关系 经单因素方差分析不同纤维化程度肝组织中miR-106b-25基因簇表达水平差异，发现1级、2级和3级纤维化肝组织中miR-106b-25基因簇表达水平高于0级(均P<0.05)，3级纤维化肝组织中miR-106b-25基因簇表达水平高于2级和1级(P<0.05)；2级纤维化肝组织中miR-106b和miR-93表达水平高于1级(P<0.05)。见表3。

表3 肝纤维化程度与 miR-106b-25基因簇表达的分析Tab.3 Analysis of hepatic fibrosis degree and expression of miR-106b-25 gene cluster

2.4 miR-106b-25基因簇各成员之间的相关性分析 miR-106b与miR-93表达水平呈正相关(r=0.815，P<0.01)，miR-106b与miR-25表达水平呈正相关(r=0.605，P<0.01)，miR-93与miR-25表达水平呈正相关(r=0.747，P<0.01)。见表4。

表4 miR-106b-25基因簇各成员之间相关性分析Tab.4 Correlation analysis among members of miR-106b-25 gene cluster

3 讨 论

泡球蚴在中间宿主肝内通过增殖以及强烈的肉芽肿反应，并向周围组织浸润对肝脏造成严重的病理损伤。由于泡球蚴的生长方式与肿瘤类似，往往借助肿瘤的浸润转移机制来研究泡球蚴的发病机理，研究结果显示免疫反应、细胞因子、信号通路、血管新生等同样在泡球蚴的致病过程中发挥着一定的作用[14]。也有研究显示泡球蚴感染后可能通过胶原沉积、细胞周期改变、介导宿主免疫应答、信号通路激活等因素造成宿主肝细胞损害，从而影响多房棘球蚴病的发病及转归[15]。本实验对20例包虫病患者肝组织手术标本进行了研究，发现在距离病灶近的部位(2 cm以内)，miR-106b-25基因簇的表达量明显高于距离病灶2 cm以外的正常肝组织，同时病理学检查发现肝纤维化均发生在距离病灶近的部位(2 cm以内)，而在距病灶2 cm以外的正常肝组织，无明显纤维化。这一结果与王俊华等[16]对泡球蚴病致肝纤维化发生在病灶周围的结果一致。

肝纤维化是多种慢性肝病进程中共同的关键病理过程。肝脏受损后,在炎症和细胞因子的作用下,处于静止状态的肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)被激活，进而合成和分泌多种细胞外基质(extracellular matrix, ECM)在肝内的过多沉积导致肝纤维化形成[17]。多项研究发现，miRNA的表观遗传调节与HSC活化相关，miRNA通过改变mRNA降解，调控转录后基因的表达，控制HSC的活化和非活化。当寄生虫感染宿主后，miRNA会通过调节多种靶基因及信号参与到损伤肝脏的进程。miR-21和miR-96可以通过靶向抑制SMAD7激活SMAD信号通路并增加胶原蛋白来促进血吸虫病相关肝纤维化表达[18-19]。miR-351作为一种抗病毒miRNA与多种肝脏疾病有关[20]。最近的一项研究发现，miR-351通过靶向维生素D 受体 (Vit D receptor, VDR) 介导血吸虫诱导的肝纤维化[21]。此外MiR-146a/b通过调节巨噬细胞分化为M2型细胞在肝血吸虫病中发挥保护作用，miR146a/b还调节乙型肝炎感染患者从肝纤维化到肝硬化的转化[22]并减轻四氯化碳(CCL4)诱导的大鼠的肝纤维化[23]。miR-203-3p可以通过抑制白细胞介素-33(IL-33)的分泌抑制血吸虫病相关肝纤维化过程。miR-203可能通过靶向SMAD3[24]和抑制心肌纤维化的功能来抑制ECM成分的合成和沉积，从而阻止HSC活化[25]。

miR-106b-25基因簇在肝癌[26]、胃癌[27]、乳腺癌[28]等肿瘤性疾病中不同程度的上调。miR-106b-25基因簇还可以通过促进上皮细胞向间质细胞的转变(Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)的形成，加重肾纤维化[29]。在导致肝纤维化方面，目前已经有证据表明miR-93和miR-106b在肝癌导致肝硬化的发展过程中持续上调[30]。miR-106b在血清中的表达水平也已被证明可用于预测肝硬化，且无论病因如何，miR-106b和miR-181都被证明可作为肝硬化的生物标志物[31]。miR-106b-25基因簇可以抑制同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN)的蛋白表达[32-33]。而PTEN的下调通过AKT途径导致过度增殖和抗凋亡活动[34]。PTEN缺陷小鼠表现出肝肿大、脂肪性肝炎、纤维化并最终发展为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma ,HCC)[35]。这表明miR-106b-25基因簇在肝癌中通过AKT途径抑制PTEN蛋白表达进而促进肝纤维化。然而泡球蚴感染人体后是否有miR-106b-25参与到了泡球蚴所致肝纤维化的过程中，目前未尚见相关报道。本次研究结果表明，靠近泡球蚴肝脏病灶的部位，miR-106b-25基因簇表达量高，纤维化程度也随之升高，miR-106b-25基因簇与肝纤维化程度呈正相关，提示着miR-106b-25基因簇参与了局部肝纤维化的进展。对miR-106b-25基因簇各成员的定量表达结果进行相关性分析,发现miR-106b-25基因簇各成员的表达存在明显相关性，可能存在协同转录。然而肝纤维化进程受到多种细胞因子及信号通路的影响，miR-106b-25基因簇具体是通过调节哪种靶基因及信号通路影响泡球蚴感染所致的肝纤维化进程，这还需要进一步实验及研究进行验证。

利益冲突：无

引用本文格式：马福财，杨德武，王 峥，等. miR-106b-25基因簇在肝泡型包虫病肝组织中的表达及意义[J].中国人兽共患病学报，2022，38(7)：631-637. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.081