氨苄西林和安普霉素对禽源沙门菌的体外联合效果和耐药突变选择窗的研究

张靖菊 徐飞 刘静 陈晨 张向阳 李秀波

(国家饲料药物基准试验室，中国农业科学院饲料研究所，北京 100081)

沙门菌是一种人畜共患病原菌，给国内肉鸡养殖业带来巨大经济损失，又因其在肉鸡生产链上的持续存而威胁人类的食品安全。目前禽场预防沙门菌病用抗菌药，但乱用滥用现象严重，导致新抗菌药研发的速度远不及细菌发生耐药突变的速度，甚至禽场产生的超级耐药菌顺着生产链传播给人类，造成无药可医的严峻局面。为放慢细菌不断获得新耐药基因的步伐，响应国家提倡的兽用抗菌药减量行动，一些专业人员提出老药新用的新思路，其中一种方法就是选择一些早期研发的经典抗菌药进行联合，提高药效，降低用量，延缓突变。氨苄西林(Ampicillin，AMP)是Ⅰ类细菌繁殖期杀菌剂，属于非限制使用级别抗菌药，主要作用于细胞壁，干扰肽聚糖的合成，在畜禽细菌病防治中应用广泛，但其对β-内酰胺酶不稳定,细菌易产生耐药性。安普霉素(Apramycin，APR)是Ⅱ类静止期杀菌剂，属于氨基糖苷类药物，也是动物专用抗生素，其抑菌原理有二，一是作用于核糖体30S亚基，干扰蛋白质的正常合成；二是使细胞膜通透性增加，导致胞内离子、酶类等重要的物质丢失，最终引起菌体死亡[1]。理论上，这两种药物联用会产生不错的协同效应，但相关基础性试验研究尚未见发表，其联用的合理性有待被证明。

防耐药突变浓度(mutation preventive concentration，MPC)和耐药突变选择窗(mutant selection window,MSW)是Drlica等[2]提出的有关耐药突变的新理论。MPC是指防止耐药性突变菌株增殖所需的最低浓度，MPC理论认为当药物浓度大于MIC时，大量敏感菌被杀灭，少量细菌会因耐药突变而被选择性增殖。MSW是指MIC～MPC之间的抗菌药浓度范围，MSW理论打破了传统的MIC理论(即用药浓度低于MIC时更易诱导细菌产生耐药突变)，认为抗菌药浓度在MSW范围内细菌才会发生耐药突变，该理论已得到诸多体内体外试验的验证。因此临床用药时最好越过MSW，更能避免耐药突变株的产生，但许多抗菌药的MSW过大，轻易越过可能会导致动物机体中毒甚至死亡。María等[3]曾对野生型铜绿假单胞菌进行磷霉素与妥布霉素的联合用药研究，发现这两种作用机制不同的药物可以互相关闭部分不耐药菌株的MSW。Xu等[4]也通过3种药物组合对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)联合作用和MSW的研究发现，有协同效果且作用机制不同的联合用药组合能显著缩小甚至关闭药物的MSW。根据MPC理论，细菌发生一次耐药突变的概率为10-6～10-10，同时发生两次突变的概率为10-12～10-16(可视为不发生)，所以细菌在两种不同作用机制的药物作用下想要存活就必须同时发生两次耐药突变，这就大大降低了突变发生的概率。近年来，养殖业关于沙门菌对AMP耐药的报导繁多[5-8]，有理由推测AMP的临床用药浓度可能落在了MSW范围内，本研究在进行AMP和APR对禽源沙门菌的体外联用效果评价的同时，也探索了AMP和APR联用能否缩小甚至关闭AMP对沙门菌的MSW，达到预防和延缓耐药的效果，以期为寻找合理的抗菌药物减量、增效和预防耐药配方提供科学依据。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

标准质控菌株大肠埃希菌ATCC25922购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)；22株禽源沙门菌均源自中国农业科学院饲料研究所国家饲料药物基准试验室菌库(2018年自山东、北京地区采集)。

1.1.2 培养基

MH营养琼脂、MH营养肉汤、沙门菌鉴别培养基XLT4琼脂购自青岛海博生物公司。

1.1.3 药品和仪器

氨苄西林(AMP)和安普霉素(APR)购自北京博普欣公司。

1.2 方法

1.2.1 单药MIC测定-微量肉汤稀释法

参照2017年CLSI发布的M100s第27版[9]推荐的操作方法及判定标准(表1)，以大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株，使用微量肉汤稀释法分别检测AMP和APR对22株临床沙门菌的最小抑菌浓度(MIC)。在96孔无菌微孔板上采用倍比稀释法用生理盐水将浓度为5120 μg/mL的抗菌药母液稀释至合适的梯度范围，每孔为100 μL药液+100 μL浓度为105CFU/mL左右的菌悬液，阴性对照为无菌有药孔，阳性对照为有菌无药孔。AMP的终浓度范围为1/8～64 μg/mL，APR的终浓度范围为1～128 μg/mL。整板置于37℃恒温培养箱孵育16～20 h观察结果。

表1 药敏试验判断标准Tab.1 Determination criteria of drug sensitivity test

1.2.2 联合药敏试验-微量肉汤棋盘稀释法

在两药单药MIC结果的基础上设计联合棋盘，棋盘规格为8×8，其中每种药物的终浓度梯度为4MIC、2MIC、1MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC(X MIC表示X倍的原单药MIC)。用生理盐水将抗菌药母液稀释至所需浓度的抗菌药工作液，随后在96孔板每孔中加入两种抗菌药液各50 μL和5.0×105CFU/mL的沙门菌菌悬液100 μL，共计200 μL，以不加菌的纯肉汤和药液作为阴性对照，整板置于37℃温箱培养16～20 h观察结果，记录AMP联用时的MIC值和APR联用时的MIC值。

以部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)作为联合药敏试验结果的判断依据。FICI=MICAMP联合/MICAMP单独+MICAPR联合/MICAPR单独。FICI≤0.5为协同作用，0.5＜FICI≤1为相加作用，1＜FICI≤2为无关作用，FICI＞2为拮抗作用[10]。

1.2.3 杀菌动力学试验-试管法

取临床菌株BJH8C002(北京某生鲜超市，S.typhimurium)和BJH8P020(北京某生鲜超市，S.thompson)进行杀菌动力学试验。根据菌株微量肉汤稀释法和棋盘法结果将试验分为4组：①1MIC浓度的AMP+菌液；②1MIC浓度的APR+菌液；③1/2MIC的AMP+1/2MIC的APR+菌液；④菌液+生理盐水。(96孔板和试管同时进行，设两组平行：96孔板每孔加100 μL所需浓度药液(两药联用时各药50 μL)和5.0×105CFU/mL菌液100 μL，并用酶标仪进行持续地动力学监测；试管中则加入1 mL 5.0×105CFU/mL菌液和1 mL药液并置于36℃±1℃恒温摇床孵育，在1、2、3、4、6、8、10和20 h取每组菌液进行菌落计数。以菌落对数值为纵坐标，时间为横坐标绘制时间-杀菌曲线。

判断标准[11]：观察在孵育的过程中是否在某一或某些时间点出现联合用药菌落计数对数值较最有效的单药组减少≥2 lgCFU/mL的情况，可定义为协同；2 lgCFU/mL＞减少量＞1 lgCFU/mL，可定义为相加；减少量≤1 lgCFU/mL时定义为无关；联合后增加量≥2 lgCFU/mL时定义为拮抗[12]。

1.2.4 不同加药顺序试验-微量肉汤棋盘稀释法

以1.2.2的联合药敏试验为同时加药联合组，另选择6株临床沙门菌以及标准质控菌ATCC25922为试验对象，进行AMP和APR不同加药顺序的联合药敏研究，分为①先AMP：先加AMP和菌液，孵育2h后再加APR；②先APR：先加APR和菌液，孵育2h后再加AMP。其余部分和同时药敏试验一致，计算FICI，并与同时联合药敏的FICI进行比较。

1.2.5 AMP对临床沙门菌防耐药突变浓度(MPC)的测定

(1)菌悬液制备 取过夜培养的沙门菌单菌落接种于20 mL MH肉汤中，37℃振荡过夜培养，离心后重悬于200 mL MH肉汤再振荡培养4～6 h，菌液浓度可达约6×109CFU/mL，6000 r/min离心后富集，用生理盐水将菌液浓度调至4×1010CFU/mL。

(2)AMP单药的MPC值测定 用倍比稀释法配制含AMP的MH琼脂培养基，2 mL不同浓度的药液与18 mL灭菌MH琼脂混匀制成药物浓度分别为1、2、……、128、256 μg/mL的单药MH琼脂培养基。取100μL菌悬液均匀涂布于每个加药培养基上，每株菌每个浓度3个平板，以保证每株菌每个浓度的总接种量＞1010CFU/mL；37℃恒温培养，观察并记录24、48和72h的细菌生长情况，以72h无菌落生长的最低药物浓度为初测MPC值(provisional MPC，MPCpr)。以MPCpr为基准，线性递减10%～20%AMP的浓度，配制浓度范围为MPCpr～1/2MPCpr的含药平板，以上述方法测定72 h无菌生长的最低药物浓度，即为精确的MPC值。

(3)AMP与APR联用的MPC值测定 两药联用时，含药MH琼脂板中APR的终浓度为其对应每株菌的MIC；AMP则以2倍稀释法从每株菌的1/16MIC稀释到MPC。两种药各1 mL，与18 mL的MH琼脂均匀混合配制成不同浓度配比组合的含药培养基，每株菌每个浓度配制3个培养基，用与“1.2.5(2)”项下相同的方法测定AMP+APR联合用药时的MPC。

(4)SI的计算和MSW的判定 根据AMP单用及AMP+APR联用对临床沙门菌的MIC、MPC值计算SI和MSW，SI=MPC/MIC[13]，且SI≥1有效，MSW为单药和联合各自MIC至MPC之间的范围。

1.2.6 统计学分析方法

使用IBM SPSS Statistics 25对结果进行Shapiro-Wilk检验、Wilcoxon符号秩和检验及配对t检验等统计学分析。

2 结果

2.1 单药和联合药敏试验结果

表2显示：对AMP和APR联用对22株临床沙门菌的FICI为0.375～1，表现为协同和相加效果；对表2中两药的单药药敏试验组和联合药敏试验组进行配对样本的Wilcoxon符号秩和检验，P＜0.05，有显著性差异。图1显示：两药联合的协同率为43.48%，相加率为56.52%，联合效果较好。

表2 AMP和APR联合药敏试验结果Tab.2 The results of the combined drug sensitivity test of AMP and APR

2.2 时间-杀菌曲线

图2显示：随着用药时间的增加，第4小时2株菌的联合用药菌落计数对数值较最有效的单药组分别减少了3.10和1.94 lgCFU/mL，前者表现为协同作用，后者表现为近似协同的相加作用。

2.3 不同加药顺序联合作用结果

将表3中的3个试验组两两配对进行配对t检验，结果均为P＞0.05，无显著性差异，因此加药顺序的不同对两种药物的联合效果无影响。

表3 加药顺序不同的联合药敏试验的FIC值Tab.3 FIC value of combined drug sensitivity test with different dosing order

2.4 AMP对临床菌的MPC测定结果

表4显示：AMP和APR联用使得AMP的防耐药突变浓度显著降低，SI值降低为原来的7.7%～40.0%。图3直观的表现出AMP和APR联用使得AMP对沙门菌的耐药突变选择窗范围显著缩小。

表4 AMP单用以及和APR联用的MPC值和SI值Tab.4 MPC and SI values of AMP alone and in combination with APR

3 讨论

3.1 AMP和APR联合

繁殖期杀菌剂AMP和静止期杀菌剂APR是禽场治疗和预防沙门菌病的常用药物，其联合优势在于两种抗菌药物的作用机制不同，多数情况下繁殖期杀菌剂作用于细胞壁，静止期杀菌剂作用于细胞壁内，联用时繁殖期杀菌剂破坏细胞壁可辅助静止期杀菌剂进入细菌细胞内发挥作用，因此常会出现相加和协同效应[14]。王新等[15]测定了APR与AMP联用对金黄色葡萄球菌的体外抗生素后效应(PAE)，结果表明，APR与AMP联用对金黄色葡萄球菌的体外PAE呈现相加或协同作用。一般来说，革兰阴性菌的细胞壁肽聚糖(繁殖期杀菌剂的靶点)含量远少于革兰阳性菌，因此很多学者认为繁殖期杀菌剂和静止期杀菌剂联用对革兰阴性菌并没有协同作用[16-17]，但本研究对22株沙门菌进行AMP和APR联合药敏试验，发现有明显的协同和相加效果，说明联合效果较好。为获得更全面的AMP和APR两药联合使用对临床沙门菌的杀菌动力学信息，又对其中两株沙门菌进行了杀菌动力学试验，时间-杀菌曲线显示出联合组的杀菌速率明显高于单独用药组，且至少表现出近似协同的相加作用。因此推测AMP和APR的联合机制可能并不是或者并不仅仅是常见繁殖期和静止期杀菌剂的协同机制，可能存在其他机制，有待进一步研究。

3.2 不同加药顺序

临床上为了更好地发挥联合药效，需考虑到两药的半衰期、抗菌机制等，从而安排合理的给药顺序。细菌在繁殖期需要大量合成以供分裂的细胞壁，先在繁殖期加入繁殖期杀菌剂破坏细胞壁更有利于后加入的静止期杀菌剂发挥作用，承晓京等[18]进行了阿奇霉素与头孢噻肟对大肠埃希菌的不同加药顺序的联合研究，发现先使用头孢噻肟(繁殖期杀菌剂)或同时给药的体外联合效果更好。因此本研究参照时间-杀菌曲线杀菌动力学结果对AMP和APR进行不同加药顺序的联合。考虑到AMP和APR在鸡体内的半衰期均为2 h左右[19]，选用的前后加药间隔时间为2 h，并比较其组间差异。结果表明不同加药顺序对沙门菌的杀菌效果无明显差异，这与预期结果出入较大，同时也从侧面反映了在“3.1”中的猜想，即可能存在非常规的协同机制。

3.3 缩小耐药突变选择窗

AMP是时间依赖型抗菌药(即药物效果与其在体内达到杀菌效果浓度的时间长短有关)，耐药突变窗理论对其十分适用，因此本研究测定了AMP对10株临床菌的MSW，范围为8～13 μg/mL不等。刘志亮等[19]对10%氨苄西林混悬液在鸡体内的药动学及生物利用度进行了研究，结果表明，10%氨苄西林的绝对生物利用度为35.27%，而禽场临床使用的氨苄西林可溶性粉的给药剂量为35～50 μg/mL，对比本次实验结果可以看出，临床用药时鸡体内血药浓度落在MSW的可能性很大，这也与AMP耐药突变株增多的报道逐年增加相对应[20-22]。接着测定了MIC浓度的APR与AMP联用的MPC，结果发现仅MIC浓度的APR就能显著缩小甚至关闭AMP对禽源沙门菌的的MSW。可见APR和AMP联用不仅能增加抗菌效果，还能通过增加菌株的选择性压力而预防和延缓耐药。

3.4 小结

总体而言，本研究证明了AMP和APR联合用药对禽源沙门菌有显著的相加和协同效果，不同的用药顺序对联合效果无影响，并且能显著缩小AMP对沙门菌的MSW范围，同时也对AMP和APR的协同机制提出一些猜想。这些初步探索可作为进一步研究AMP和APR体内联合用药时PK/PD模型的理论依据，为最终研制出既减少抗菌药用量又延缓耐药的复方制剂提供宏观研究基础。