杜仲纯中药制剂和松脂醇二葡萄糖苷对自发性高血压大鼠肾脏微循环血流灌注及其频谱特征的影响*

王 琴 张晓艳 刘雪婷 杨小杰 李爱玲 李宏伟 杨义力 韩建群, #

尽管在高血压病预防和治疗策略方面取得了巨大进步，但其仍然是目前世界范围内疾病负担的重要危险因素之一[1,2]。几乎所有确定的人类孟德尔型高血压的致病基因都涉及到肾脏功能，而且大多数常用的高血压动物模型都存在肾功能异常。肾脏只占人体总重量的1%，但在静息状态下，大约有20%的血液流向肾脏。微循环对于肾脏的功能至关重要，因为它在向肾脏微循环输送氧气方面起着关键作用[3,4]。激光多普勒血流探测仪(Laser Doppler Flowmetery, LDF)是一种可以对微循环血流灌注进行半定量检测的仪器。小波分析(Wavelet analysis)是一种可对LDF血流灌注信号进行时频分析的方法，可将不同生理机制对微血流灌注的影响区分开来，从而提供关于微血流灌注的更丰富的信息。

作为传统中药，杜仲具有广泛的生物活性如抗高血压、抗高血糖、预防骨质疏松等[5,6]。松脂醇二葡萄糖苷(Pinoresinol Diglucoside,PDG)是杜仲的主要活性成分之一，也是杜仲药材质量控制的重要指标[7,8]。全杜仲胶囊(Total Eucommia Capsule,EU)是一种采用现代提取工艺制备而成的杜仲(100%杜仲皮)中成药制剂，在辅助治疗高血压、骨质疏松、骨关节炎方面效果显著[9,10]，但其具体作用机制目前尚不明确。本文旨在探讨EU和PDG对SHRs肾脏微循环血流灌注及其频谱特征的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、主要药物、试剂和仪器

30只7-8周龄，体重180-190g的雄性自发性高血压大鼠(SHR)和6只正常血压的Wistar Kyoto rats (WKYs)大鼠均购自北京维通利华实验动物有限公司。所有动物饲养于12h昼夜交替，恒温(23℃±2℃)恒湿(50%±10%)环境中，且自由饮食和进水。EU(批号200101，0.48g/粒，相当于原药材2.5g)由江西普正制药股份有限公司提供。PDG(纯度>98%)购自成都瑞芬思生物科技有限公司。双通道激光多普勒血流检测系统(Moor VMS，Moor Instruments公司)，配套VP4探头，仪器配套分析软件为Moor VMS PC 3.1。激光多普勒血流成像系统(moor LDI-HIR)为Moor Instruments公司产品，仪器配套软件为mLDI 软件Version 5.3。

1.2 动物分组及处理

动物分组：动物适应性喂养1周后，将30只SHRs随机分为SHR组、SHR+EU组、SHR+PDG(L)组、SHR+PDG(M)组和SHR+PDG(H)组，每组6只。Control组为6只WKYs大鼠。

处理：Control组和SHR组纯净水灌胃。SHR+EU组：EU灌胃，生药6g/kg[11]，临用时称取一定量的EU粉末，研磨，纯净水混悬。SHR+PDG共3组：PDG灌胃，其中低剂量(L)8.75mg/kg，中剂量(M)17.5mg/kg，高剂量(H)35mg/kg[12]。临用时称取一定量的PDG粉末，纯净水混悬。灌胃容量0.15ml/10g。上述干预均连续进行2个月，1次/日。

1.3 血压测量

使用Softron BP-2010A智能无创血压仪分别于治疗前、治疗1个月和治疗2个月时测定大鼠尾动脉收缩压(Systolic Blood Pressure,SBP)。具体操作如下：前一晚禁食不禁水，第二天白天于室温下，在大鼠清醒、安静时，将其放置于加热套内，暴露尾巴，将压力传感器按方向套于其尾巴根部，待加热套升温并稳定在38℃约8min后，测量大鼠SBP。每只大鼠测量3次，取平均值。

1.4 LDF血流灌注、血流速度及血细胞聚集度检测和激光多普勒血流成像分析

给药2个月后，进行下述检测。大鼠持续吸入2%异氟烷与50%O2+50%N2混合气体进行麻醉后，取仰卧位，固定于操作台，碘伏消毒腹部皮肤，腹部正中线切开，暴露肾脏。

1.4.1 肾脏血流灌注、血流速度和血细胞聚集度检测：使用双通道激光多普勒血流检测系统捕获肾脏微循环的LDF信号。微血管血流灌注单位(PU)用折线图表示。采用Moor VMS PC 3.1分析微血流动力学参数的变化，包括平均血流灌注、血流速度和血细胞聚集度。

1.4.2 激光多普勒血流成像分析：使用激光多普勒血流成像系统进行肾脏的血流成像分析，采用仪器配套软件mLDI Version 5.3分析血流灌注情况。仪器配套的数据分析软件可直接输出监测期内(2-3min)微血流动力学参数数值，选取较平稳时段(1min)的均数进行统计学分析。

1.5 小波分析

双通道LDF血流仪配套的Moor VMS PC 3.1分析软件可将捕获的正弦波式LDF信号转换为Morlet小波。得到相应指标的数值后，使LDF信号转换成五个不同生理来源的特征频段，即内皮NO非依赖性内皮源性(0.005-0.01Hz)、NO依赖性内皮源性(0.02-0.05Hz)、神经源性(0.02-0.05Hz)、肌源性(0.05-0.15Hz)、呼吸源性(0.15-0.4Hz)和心源性(0.4-2.0Hz)。输出结果为包含时域和频域信息的三维(3D)图像，将小波系数矩阵沿时间轴平均，提取小波频段-幅值二维图[13]。由于内皮细胞在调控微血管张力方面具有重要作用，故本研究选择NO非依赖性和NO依赖性内皮源性频段信号进行观察分析。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠SBP水平变化

治疗前(8-9周龄)，各组大鼠SBP无显著性差异(P>0.05)。治疗1个月后(12-13周龄)和2个月后(16-17周龄)，与Control组比较，SHR组SBP显著升高(t=6.67、5.37，P<0.01)。与SHR组比较，治疗1个月后，SHR+EU组和SHR+PDG(H)组大鼠SBP显著降低(t=2.40、2.75，P<0.05)，而SHR+PDG(L)组和SHR+PDG(M)组SBP变化无显著差异(t均<1.90，P>0.05)。治疗2个月后，SHR+EU组和各剂量PDG组大鼠SBP与SHR组比较无统计学差异(t均<2.10，P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠SBP水平比较

2.2 各组大鼠肾脏微血流灌注水平比较

各组大鼠LDF血流灌注水平和LDPI血流灌注水平差异均有统计学意义(P<0.01)。与Control组相比，SHR组大鼠肾脏呈现低血流灌注模式(t=14.13，P<0.01)。治疗2个月后，与SHR组相比，SHR+EU组和SHR+PDG各剂量组的肾脏LDF血流灌注显著升高(t>31.25,P<0.01)。与Control组相比，SHR组肾脏LDPI血流灌注显著降低(t=5.08，P<0.01)。治疗2个月后，与SHR组比较，SHR+EU组和SHR+PDG各剂量组(低剂量组除外)肾脏LDPI血流灌注显著增加(t=7.22、5.72、10.23，P<0.01)。见图1、表2。

表2 各组大鼠肾脏微血流灌注水平比较

注：A，各组LDF血流灌注折线图；B，各组LDPI血流灌注图

2.3 各组大鼠肾脏微循环血流速度和血细胞聚集度比较

各组大鼠肾脏微循环平均血流速度和血细胞聚集度水平差异均有统计学意义(P<0.01)。与Control组比较，SHR组大鼠肾脏血流速度显著降低(t=137.50，P<0.01)；与SHR组比较，SHR+EU组和SHR+PDG各剂量组的肾脏微血流速度显著升高(t均>36.34，P<0.01)。SHR组肾脏微血管血细胞聚集度显著高于Control组(t=32.25，P<0.01)；与SHR组比较，SHR+EU组和SHR+PDG各剂量组大鼠肾脏微血管血细胞聚集度则显著降低(t均>33.00，P<0.01)。见图2、表3。

表3 各组大鼠肾脏微循环平均血流速度和血细胞聚集度比较

注：A，各组肾脏微血流速度折线图；B，各组肾脏血细胞聚集度折线图

2.4 各组大鼠肾脏微循环血流灌注内皮源性频段幅值比较

与Control组相比，SHR组肾脏LDF信号频谱图特征峰分布规律明显不同(图3)；NO非依赖和NO依赖内皮细胞源频段幅值均显著降低(t=9.91、5.51，P<0.01)。与SHR组相比，SHR+EU组和SHR+PDG中、高剂量组的NO依赖内皮细胞源频段幅值均显著升高(t=4.58、9.47、7.95，P<0.01)(图3，表4)。与SHR组相比，SHR+PDG中、高剂量组的NO非依赖内皮细胞源频段幅值均显著升高(t=4.24、10.86，P<0.01)，而SHR+EU组和SHR+PDG(L)组该频段幅值水平差异无统计学意义(t=1.07、0.03，P>0.05)(图3，表4)。同时，三维时-频图显示，SHR组大鼠肾脏内皮细胞源(NO依赖性和NO非依赖性)频段(箭头示)幅值低于Control组,与SHR组比较,SHR+EU组和SHR+PDG各剂量组，尤其是中、高剂量肾脏内皮细胞源频段幅值明显升高(图4)。

表4 各组大鼠肾脏微血流灌注在内皮源频段小波系数绝对值的比较

图3 各组大鼠肾脏微血流灌注信号在6个特征频段的频谱分布图

图4 各组大鼠肾脏微血流灌注信号在6个特征频段的三维时-频图

3 讨 论

本研究结果表明，与Control组比较，SHRs大鼠的肾脏微血流灌注水平和血流灌注LDF信号经小波变换后的内皮源性频段幅值均显著降低，EU和PDG可改善SHRs肾脏微血流灌注水平以及内皮源性频段幅值。

在中国，杜仲治疗高血压的历史由来已久，前期的研究报道[15]，杜仲的总水提物或其中某些低含量物质如PDG(30mg/kg)和京尼平苷酸(Geniposide Acid，GPA，30mg/kg)具有较理想的降压效果[14]。然而，PDG和GPA在杜仲中的含量非常低(一般<0.3%)，并不能解释为什么6g/kg的杜仲生药就能使SHRs的血压下降，表明杜仲的降压作用可能是多种活性成分协同作用的结果。与前期研究结果一致[15,16]，本实验结果也表明，EU和高剂量(35mg/kg)PDG治疗一个月可显著降低SHRs的血压。出乎意料的是，治疗两个月后，SHRs血压与未经过治疗的SHRs相比，虽然略微下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。此结果可能与给药方式和EU使用剂量有关，有待进一步研究。另外，目前临床上，杜仲中药制剂主要作为佐使药联合卡托普利或缬沙坦等治疗高血压[17-19]。

无论引发血压升高的机制如何，长期高血压最终将导致全身血管系统功能和结构的改变。这些变化既发生于大血管系统，也发生在微血管系统中。微血管网络的充分灌注对于维持组织和器官功能的完整性至关重要，组织的气体交换、营养物质的供应和代谢物的清除几乎完全发生在微循环中。与高血压相关的外周血管阻力的改变主要与微血管网络的改变有关。70%—90%的全身动脉压力被传递到微循环，因此，微循环系统对血流阻力的贡献较大。高血压时，小动脉和微动脉的功能性特征发生了很大改变，导致毛细血管灌注受损[20]。这种阻力升高的主要原因有：(1)小动脉和微动脉口径变小；(2)小动脉和微动脉壁腔比增加；(3)小动脉或微动脉数量减少；(4)内皮功能受损;(5)血液流动受损。此外，高血压状态下，微血管密度的降低也可能导致器官血流量减少和器官间血液重新分配，从而阻碍器官代谢营养物质的交换[21,22]。本研究结果表明，与血压正常的WKYs大鼠相比，SHRs大鼠肾脏微血流灌注水平和微血流速度显著降低。高血压时，人体内红细胞的机械和生化特性发生了改变。原发性高血压患者的SBP、DBP、MAP的升高以及左心室质量的增加与红细胞聚集度增加有关[23]。本研究结果也发现，SHRs肾脏血细胞聚集度显著高于血压正常的WKYs。EU和各剂量PDG治疗两个月可显著提高SHRs肾脏微血流灌注、血流速度并降低血细胞聚集度。表明EU和PDG对高血压导致的肾脏微循环功能障碍具有保护作用。

小波分析在高频率时具有良好的时间分辨率，在低频率时具有良好的频率分辨率。这种多分辨率时频分析已被证明是一种分析非平稳生物信号的好方法，例如肌电信号和皮肤血流信号。在时域和频域分辨率达到最优的前提下，小波分析可将LDF血流灌注振荡转换为五个特征频段，其中每个频段代表不同生理调节机制。微血管内皮细胞是微循环的基本功能单元，其与周细胞协同作用调控微血管管径和微血管的舒缩，进而调控器官血流灌注水平和功能状态。本研究比较了各组大鼠肾脏血流灌注LDF信号经过小波变换后的频谱特征，结果显示，与WKYs大鼠相比，SHRs大鼠的肾脏内皮源性频段幅值显著降低，EU和PDG治疗可使该幅值显著升高，表明EU和PDG对高血压时肾脏微血管内皮细胞具有保护作用。

综上所述，SHRs肾脏存在微血流动力学异常和内皮功能障碍，EU和PDG治疗后可显著改善SHRs肾脏的微血流动力学和内皮功能。

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本文第一作者简介：

王 琴(1984-)，女，汉族，助理研究员，研究方向：微血管内皮功能障碍