益生菌联合消退素D1对牙周炎大鼠牙龈组织中炎症因子、正五聚体蛋白3和氧化应激的影响

牙周炎是一种非特异性的炎性疾病，牙龈红肿、牙龈出血及牙齿松动等是其常见的临床表现，牙周炎的发生涉及氧化应激、炎症、信号传导等多个过程，寻找有效药物改善牙周炎是目前亟待解决的问题

。消退素可分成E类和D类，D类消退素主要来源于二十二六烯酸，消退素D1属于D类消退素，具有消炎、镇痛等作用

。已经证明消退素D1对牙周炎有治疗功效

。益生菌是一种微生态制剂，能够调节免疫、降低胆固醇、改善消化系统

。临床研究

显示，益生菌可减轻慢性牙周炎患者出血、疼痛等症状，有美学修复效果。本次探讨益生菌联合消退素D1对牙周炎大鼠的影响及可能机制，为临床上牙周炎的治疗提供参考思路。

内蒙古额仁高比一带发育大量的早白垩世白音高老组的火山岩，分析地区白音高老组火山岩岩石地球化学特征，对揭示该时期岩浆作用具有重要地质意义。通过1∶5万区域地质调查工作，探讨其成因以及形成的大地构造环境。

1 材料和方法

1.1 药品和试剂：MDA检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；益生菌购自法国Lactibiane；IL-1β检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；兔抗MMP-2抗体、兔抗p-p38MAPK抗体购自美国Cell Signaling Technology；IL-6检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；TNF-α检测试剂盒购自深圳市拓普生物科技有限公司；兔抗PTX3抗体购自美国Invitrogen；兔抗NF-κBp65抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；GSH-Px检测试剂盒、SOD检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司；兔抗MMP-9抗体购自美国Abcam；消退素D1购自美国Sigma。

(3)要对各种管道配件的外形、尺寸“心中有数”，尤其是大口径的管道配件，不但安装时占用的空间大，还需要一定的操作空间，因此布置时一定要核对尺寸，不能盲目布置。配件的外形、尺寸等参数可以从有关手册、标准图和厂家的技术资料中查到。

1.2 主要实验仪器：UV7分光光度计购自瑞士梅特勒-托利多；318C+酶标仪购自上海沛欧分析仪器有限公司；DYCSCZ7电泳仪购自北京东方瑞利科技有限公司。

1.3 实验动物：健康SD大鼠，8周龄，体重280～320 g，购自天津市中医药大学第一附属医院，许可证号：SCXK(津)2020-0005。

1.4.2 牙龈出血指数、菌斑指数及探诊深度检测：①牙龈出血指数。用探针轻触牙周袋、龈沟，游离的龈缘没有炎症，不出血，记为0分；游离的龈缘没有红肿，但出血，记为1分；游离的龈缘红肿、水肿，出血，记为2分；牙龈红肿，出现溃疡，记为3分；②探诊深度。将有刻度的细探针探诊牙周袋，选取中颊、远中颊以及侧颊共3个测量点，最后取均值；③菌斑指数。将菌斑染色溶液涂抹在选用牙上，孵育30 s，用自来水洗涤10 s，观察牙面紫红色，0分表示近龈缘区域没有菌斑，1分表示近龈缘区域有薄菌斑，2分表示龈缘、邻面存在菌斑，3分表示龈沟、邻面、龈缘存在大量菌斑。

1.4.1 模型构建和分组：结合相关文献构建牙周炎动物模型

。腹腔注射10%的水合氯醛麻醉大鼠，将牙龈剥离，用0.2 mm直径的正畸结扎丝将大鼠左侧上颌第一磨牙结扎，结扎的丝线置于龈沟内。结扎后，大鼠饲喂高糖饲料（面粉6 g、脱脂奶粉28 g、蔗糖56 g、肝粉1 g、酵母粉4 g，少量食盐以及蔬菜），饮用200 g/L的糖水。4周后，肉眼观察大鼠牙龈红肿，触摸容易出血，牙齿松动，表明造模成功。

1.4 实验方法

1.4.3 ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平：取牙龈组织，用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α含量，步骤分别根据IL-1β检测试剂盒、IL-6检测试剂盒、TNF-α检测试剂盒操作说明进行。

1.4.4 Western blot检测PTX3、NF-κBp65、p-p38MAPK、MMP-9、MMP-2蛋白表达水平：取牙龈组织，添加含有PMSF的RIPA溶液，充分裂解，4℃，12 000 g离心10 min。取上清，与5×Loading Buffer混合，在100℃孵育5 min。每个泳道内添加50 μg的蛋白样品，首先设置90 V的电压电泳30 min，然后设置120 V的电压电泳1.5 h，肉眼观察蓝色染料进入分离胶的底部位置，停止电泳。NC膜根据分离胶的大小裁剪，设置100 V电压转膜2 h。NC膜浸泡在5%牛血清白蛋白溶液中，室温结合2 h。然后把NC膜放在一抗溶液内，4℃过夜反应。NC膜浸泡在二抗内，室温结合2 h。按照ECL方法显色。GAPDH作为参照，根据条带的灰度值分析目的蛋白表达量变化。PTX3、p38MAPK一抗按照1:800稀释，MMP-9、MMP-2、NF-κBp65一抗按照1:1 000稀释，p-p38MAPK一抗按照1:600稀释。二抗均按照1:4 000稀释。

2.3 益生菌联合消退素D1抑制牙周炎大鼠牙龈组织中PTX3表达：与对照组比较，模型组大鼠牙龈组织中PTX3蛋白表达量升高，差异有统计学意义（

＜0.05）；与模型组比较，益生菌组、消退素D1组、联合组大鼠牙龈组织中PTX3蛋白表达量均降低，差异有统计学意义（

＜0.05）；与益生菌组、消退素D1组比较，联合组大鼠牙龈组织中PTX3蛋白表达量降低，差异有统计学意义（

＜0.05）。见图1、表3。

2.2 益生菌联合消退素D1对牙周炎大鼠牙龈组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影响：与对照组比较，模型组大鼠牙龈组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量均升高，差异有统计学意义（

＜0.05）；与模型组比较，益生菌组、消退素D1组、联合组大鼠牙龈组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量均降低，差异有统计学意义（

＜0.05）；与益生菌组、消退素D1组比较，联合组大鼠牙龈组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量均降低，差异有统计学意义（

＜0.05）。见表2。

2.1 益生菌联合消退素D1对牙周炎大鼠牙龈出血指数、菌斑指数及探诊深度的影响：与对照组比较，模型组大鼠牙龈出血指数、菌斑指数及探诊深度均升高，差异有统计学意义（

＜0.05）；与模型组比较，益生菌组、消退素D1组、联合组大鼠牙龈出血指数、菌斑指数及探诊深度均降低，差异有统计学意义（

＜0.05）；与益生菌组、消退素D1组比较，联合组大鼠牙龈出血指数、菌斑指数及探诊深度均降低，差异有统计学意义（

＜0.05）。见表1。

造模成功的大鼠分成模型组、益生菌组、消退素D1组及联合组，每组11只。益生菌组从第5周开始，灌胃2 ml的益生菌液（5×10

CFU/ml）

；消退素D1组从第5周开始，尾静脉注射2 μl的100 ng/ml的消退素D1

；联合组从第5周开始，灌胃2 ml的益生菌液（5×10

CFU/ml），并尾静脉注射2 μl的100 ng/ml消退素D1。各组大鼠每天用药1次，连续用药4周。模型组大鼠用生理盐水代替药物。选取11只对照组大鼠，按照同样方法麻醉，但不结扎。各组大鼠检测牙龈出血指数、菌斑指数、探诊深度后，取大鼠牙龈组织，分别用于炎症因子检测、蛋白表达检测和氧化应激指标检测。

2 结果

封建社会的传统是民敬官，民不能与官斗，因为胳膊拧不过大腿；下级不能与上级斗，因为官大一级压死人。封建社会里百姓称官员为“官老爷”，官不畏民，几乎没有官员认为自己也是百姓，像高以永既承认自己是百姓，还写成对联挂在县衙三堂自勉的官员更是凤毛麟角。他们多数会摆足官架子，骑在老百姓的头上作威作福；偶有良善一些，稍微替老百姓做点事儿的官员，老百姓就会感激涕零，山呼青天大老爷。

1.4.5 SOD、MDA、GSH-Px检测：取牙龈组织，用比色法检测SOD、GSH-Px含量，分光光度计法检测MDA含量，步骤分别按照SOD检测试剂盒、MDA检测试剂盒、GSH-Px检测试剂盒说明书进行。

汉字是不同与拼音文字的一种特殊的表义体系的文字，具有拼音文字所不具备的形音义关系，形声字就是这种关系的最好的体现。如果留学生能够提纲挈领地学习形声字，了解和掌握形声字的规律和特点，从而增强识字能力，减轻认字负担。由此可见，形声字教学在对外汉字教学中占有重要的地位，所以对外汉语教师应该在汉字教学过程，充分利用形声字自身所具有的音义理据，针对外国留学生的水平，制定出一套有效的形声字教学方法。

2.4 益生菌联合消退素D1对牙周炎大鼠牙龈组织中SOD、MDA、GSH-Px的影响：与对照组比较，模型组大鼠牙龈组织中SOD、GSH-Px含量降低，MDA含量升高，差异有统计学意义（

＜0.05）；与模型组比较，益生菌组、消退素D1组、联合组大鼠牙龈组织中SOD、GSH-Px含量升高，MDA含量降低，差异有统计学意义（

＜0.05）；与益生菌组、消退素D1组比较，联合组大鼠牙龈组织中SOD、GSH-Px含量升高，MDA含量降低，差异有统计学意义（

＜0.05）。见表4。

本文通过选取适宜的分析谱线和仪器工作参数，不同的积分、观测方式，实现了同时测定Cu、Fe、Ni、Cd、Zn、Mn、Ca、Mg、Na、Si、As、S，采用内标法补偿因钴盐基体对待测元素的影响，经试验验证可用于钴产品生产过程CoCl2净化液和Co(NO3)2净化液中Cu、Fe、Ni、Cd、Zn、Mn、Ca、Mg、Na、Si、As、S等12种元素的测定。也可用于金属Co、Co3O4、Co(OH)2等钴产品中上述元素的测定。

2.5 益生菌联合消退素D1抑制牙周炎大鼠牙龈组织中NF-κBp65、p-p38MAPK、MMP-9、MMP-2蛋白表达：与对照组比较，模型组大鼠牙龈组织中NF-κBp65、p-p38MAPK、MMP-9、MMP-2蛋白表达量升高，差异有统计学意义（

＜0.05）；与模型组比较，益生菌组、消退素D1组、联合组大鼠牙龈组织中NF-κBp65、p-p38MAPK、MMP-9、MMP-2蛋白表达量降低，差异有统计学意义（

＜0.05）；与益生菌组、消退素D1组比较，联合组大鼠牙龈组织中NF-κBp65、p-p38MAPK、MMP-9、MMP-2蛋白表达量降低，差异有统计学意义（

＜0.05）。见图2、表5。

2月20日，水利部直属机关2012年党的工作会议在京召开。水利部党组书记、部长陈雷出席会议并作重要讲话。中央国家机关工委副书记俞贵麟到会指导并讲话。水利部党组副书记、副部长矫勇主持会议。水利部党组成员、中纪委驻部纪检组组长董力传达中央国家机关第二十六次党的工作会议暨第二十四次纪检工作会议精神。水利部党组成员、副部长、直属机关党委书记周英作工作报告。水利部副部长胡四一，水利部党组成员、副部长李国英，总工程师汪洪，总规划师兼规划计划司司长周学文出席会议。

3 讨论

牙周炎与慢性炎症、氧化应激等有关

。IL-1β、IL-6、TNF-α是常见的炎症因子，其表达增多后可诱导炎症反应，加快炎症损伤

。PTX3属于炎性反应蛋白，PTX3表达改变与牙周炎慢性炎症相关

。氧化应激是由过量的氧自由基引起的，而氧自由基的积累与机体内抗氧化酶SOD、GSHPx等的水平有关；过量的氧自由基能够将脂质过氧化，生成MDA，因此检测MDA含量变化可间接反应氧化应激水平

。

益生菌能够改善宿主免疫水平、改善腹泻

。益生菌对牙周炎患者有治疗作用

。益生菌还可降低牙周炎患者炎症因子TNF-α、IL-1β水平

。消退素D1有抑制炎症等作用

。消退素D1处理后的牙周炎大鼠IL-1β、IL-6水平降低，牙龈指数明显改善

。本实验显示，益生菌、消退素D1治疗后的牙周炎大鼠牙龈出血指数、菌斑指数及探诊深度明显降低，并且牙龈组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平和PTX3蛋白表达量减少，提示益生菌、消退素D1可降低牙周炎炎症，改善牙龈出血等症状，与之前的研究报道结果一致，均说明益生菌、消退素D1对牙周炎有治疗功效。本实验还显示，益生菌、消退素D1治疗后的牙周炎大鼠SOD、GSH-Px水平升高，MDA水平降低，并且两者联合后效果更佳，说明益生菌和消退素D1还可以降低牙周炎氧化应激水平，益生菌联合消退素D1对牙周炎治疗效果更好。

进一步分析发现，益生菌、消退素D1降低牙周炎大鼠牙龈组织中NF-κBp65、p-p38MAPK、MMP-9、MMP-2蛋白表达量。牙周病原微生物可激活Toll受体，诱导p38MAPK信号活化，进而激活NF-κB信号通路，促进炎症因子生成，诱导炎症

。p38MAPK、NF-κB信号还可调控氧化应激、细胞外基质降解等过程，促进氧化损伤和牙龈损伤

。MMP-9、MMP-2能够促进牙周炎症过程中外基质降解，加快牙龈损伤

。本次实验说明，益生菌、消退素D1可能通过抑制p38MAPK、NF-κB信号改善牙周炎炎症损伤、氧化应激和牙龈损伤。益生菌联合消退素D1可能是未来牙周炎治疗的有效途径。

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