鲎血蛋白-白蛋白纳米粒的制备及性质表征

文铭森，钟镇东，吴育廉，康信煌，邓春梅，张国光

（广东海洋大学 化学与环境学院，广东 湛江 524088）

鲎是重点保护海洋动物，血液因含有铜离子而显蓝色，含有多种具备药用价值的物质，其蛋白及其多肽具有生物学活性，但是体外稳定性较差，靶向性也较低，不可被人类直接利用。目前，鲎血多被用于提取鲎素来制备广泛用于注射液、生物制品等方面的鲎试剂[1]。本研究尝试用白蛋白对鲎血蛋白进行包埋，形成载鲎血蛋白的白蛋白纳米粒，以期提高鲎血蛋白的稳定性、靶向性以及生物学活性。

1 材料

1.1 仪器

台式高速冷冻干燥机（HR/T20M型，上海田枫实业有限公司）；扫描电镜（MIRA3型，TESCAN泰思肯有限公司）；紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；数显恒流泵（HL-2B型，上海泸西分析仪器厂有限公司）；旋转蒸发器（RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂）；超声波清洗器（WD-9415B型，北京市六一仪器厂）；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S，河南省予华仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

牛血清白蛋白、鲎血浆粗粉、无水乙醇、25.00%戊二醛溶液、十二水合磷酸氢二钠、葡聚糖凝胶G-100、考马斯亮蓝G-250、磷酸二氢钾、二水合磷酸二氢钠。

2 方法与结果

2.1 鲎血脱铜蛋白和水解蛋白的制备

2.1.1 鲎血脱铜蛋白的提取

称取一定量鲎血浆粗粉于干净、干燥的25.0 mL锥形瓶中，加入10.0 mL蒸馏水、10.0 mL 0.90% NaCl溶液和3.4 mL pH=6的磷酸盐缓冲溶液搅拌溶解，盖上蒸发皿，在65 ℃的水浴锅中搅拌25 min后，冷却至10 ℃，离心1.0 h。取上清液于干净、干燥的25.0 mL锥形瓶中，加入25.0 mL 0.1 mol/L的EDTA二钠溶液，盖上蒸发皿，在30 ℃水浴锅中搅拌25 min，再加入与EDTA二钠溶液体积相同的丙酮溶液，搅拌20 min后离心得沉淀。取沉淀于干净的锥形瓶中，用10.0 mL蒸馏水清洗离心管，倒入锥形瓶中，加入20.0 mL 0.1 mol/L的EDTA二钠溶液，盖上蒸发皿，然后放入30 ℃水浴锅中水浴搅拌20 min，后加入与EDTA二钠溶液体积相同的丙酮溶液，继续30 ℃水浴搅拌10 min，然后将溶液倒入离心管中，放入离心机中离心30 min。将离心管中的上清液倒掉，用蒸馏水稍微冲洗离心管内壁，向离心管中加入少许蒸馏水，用玻璃棒将沉淀搅拌混匀，然后用蒸馏水冲洗玻璃棒，并加蒸馏水至离心管的约3/4处，将离心管放入离心机中离心30 min，重复这一步骤3次。最后取3次离心后的沉淀，用保鲜膜封口冷冻一晚，再冷冻干燥1天，得到鲎血脱铜蛋白粉末。

2.1.2 鲎血水解蛋白的制备

根据专利“一种鲎血浆蛋白的水解方法”[2]，取一定量上述粉末加入胰蛋白酶，用磷酸盐缓冲液调节pH至8.0，50 ℃恒温水解搅拌3.0 h后，取上清液过滤，冷冻干燥得鲎血水解蛋白粉末。

2.2 载鲎血水解蛋白-白蛋白纳米粒制备方法

分别取50 mg鲎血水解蛋白与100 mg白蛋白，加入4.0 mL磷酸盐缓冲液（pH=8）搅拌溶解，在溶液浑浊时加入35 μL 25.00%戊二醛，同时，用恒流泵以4 r/min的速度缓慢逐滴加完25.0 mL无水乙醇，待无水乙醇滴完后使用保鲜膜进行包封，持续搅拌得到纳米粒溶液[3]。

2.3 正交实验设计

以纳米粒包封率为指标，从搅拌时间、磷酸盐缓冲液pH、搅拌速度等方面探寻最适条件。每个因素采用3个水平，按照L9（33）正交设计表进行实验，因素如表1所示，结果如表2所示。

表1 正交设计因素

由表2可知，最优纳米粒制备条件为A1B2C3，即以磷酸盐缓冲液pH为9.0、搅拌时间为10.0 h、搅拌速度为1 400 r/min为最佳条件。

表2 正交设计结果分析

2.4 包封率与载药量的测定方法

2.4.1 样品的预处理

用旋转蒸发器将样品中的无水乙醇全部蒸出后，加入适量蒸馏水和少量聚乙二醇超声，以转速1 200 r/min高速离心，取出全部上清液定容于25.0 mL容量瓶，保留载鲎血蛋白-白蛋白纳米粒固体[4]。取2.0 mL上述溶液于G100葡聚糖凝胶柱中分离，分离出游离的鲎血水解蛋白。将分离出来的载鲎血蛋白-白蛋白纳米粒固体和游离的鲎血水解蛋白真空冷冻干燥后，得待测鲎血水解蛋白粉末、纳米粒粉末。

2.4.2 样品包封率与载药量的测定方法

用2.0 mL水充分溶解鲎血水解蛋白粉末，取1.0 mL溶液加入5.0 mL考马斯亮蓝溶液中，充分反应后，用紫外-可见分光光度计在λ=595 nm处测量，得游离鲎血蛋白质量。用电子分析天平称量纳米粒粉末，得纳米粒粉末质量。计算公式：

式中：W总为鲎血水解蛋白总药量，W游为游离鲎血蛋白质量，W纳米粒为载鲎血水解蛋白-白蛋白纳米粒粉末总质量，包封率为72.79%±1.16%，载药量为38.81%±1.36%。

2.4.3 体外释放实验

分别称取一定量载药纳米粒、游离水解蛋白于截留量为70 kDa的透析袋中，加入3.0 mL PBS溶液（pH=7.4），使质量浓度达到20 mg/mL。用透析夹夹紧密封透析袋，将透析袋悬浮于30.0 mL PBS溶液的培养皿内，置于恒温振荡仪（37 ℃、100 r/min）中，分别在0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0 h准确取出1.0 mL缓冲液，并及时添加等量37 ℃新缓冲液。取出的1.0 mL溶液用考马斯亮蓝法、紫外-可见分光光度计（波长为595 nm）测定吸光度。根据计算公式3算出水解蛋白的累积释放率，得体外释放曲线（见图1）。由图1可知，鲎血水解蛋白溶液于0.5 h后基本被全部释放；载药纳米粒于3.0 h后开始大量释放，到12.0 h时基本释放完成，说明载药白蛋白纳米粒有较好的缓释效果。

图1 体外释放曲线

2.5 纳米粒的表征

将制得的载药纳米颗粒放入烧杯中，用保鲜膜密封，超声2.0 h后冷冻干燥得到样品，然后进行实验，扫描电镜如图2所示。由图2可知，载鲎血水解蛋白-白蛋白纳米粒的粒径大约为500 nm。

图2 扫描电镜图

3 结语

用去溶剂化法制备载鲎血蛋白-白蛋白纳米粒，用白蛋白包埋的方式提高鲎血蛋白作为蛋白类药物的稳定性、靶向性以及生物学活性。由各单因素设计实验可知，载鲎血蛋白-白蛋白纳米粒的包封率为72.79%±1.16%、载药量为38.81%±1.36%，粒径大部分为500 nm。通过体外释放实验发现，载药纳米粒的缓释作用较好。