新型鸭呼肠孤病毒研究进展

马明瑞，陈 浩，张 斌

（1.内蒙古师范大学 生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010022；2.曲阜师范大学 生命科学学院，山东 曲阜 273165）

新型鸭呼肠孤病毒（Novel Duck Reovirus，NDRⅤ）隶属于呼肠孤病毒科（Reovirdae）、正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus），其基因组由10个双链RNA片段组成[1]。在临床上，NDRⅤ会降低雏鸭出雏率，在雏鸭或成鸭感染早期无明显特殊症状，但在后期鸭子生长发育变得迟缓，导致体重偏轻，同时生产性能急剧下降，表现出精神萎靡，羽毛凌乱、粗糙以及排白色稀粪等症状。该病发病日龄较小，多发生于3～25日龄，病程为5～7日。病原可通过消化道和呼吸道感染，病情发展迅速。脾脏和法氏囊是病毒感染的主要靶器官，淋巴细胞是主要的靶细胞，病毒感染后引起脾脏坏死导致免疫力下降，易受其他病原微生物感染（霉菌毒素及其他病毒混感），因此死亡率较高。剖检病变为肝脏表面出现大量针尖大小的白色坏死灶和大量出血点，脾脏肿大，有出血的症状，呈暗红色，表面有许多灰白色的坏死点，有的汇聚在一起呈花斑状。心脏、肾脏、法氏囊等有时也能见到出血病变。呼肠孤病毒感染已成为危害我国禽生产的主要疫病之一，该病的发病流行没有明显的季节性，多种水禽都可以感染呼肠孤病毒，并因此发病和死亡，或引起继发感染，造成更大的经济损失[2]。NDRⅤ的传播方式可分为水平传播和垂直传播两种。水平传播是带毒家禽之间直接或者间接引起的；垂直传播主要是通过卵的传播。在生殖器中已经证明该病毒的存在，但是经过卵传播的概率较低[3]。近年来，该病在我国部分省市均有发生，严重影响了养鸭业的发展。我国不同地区流行的不同呼肠孤病毒株具有宿主差异性、地域差异性及致病性多样化的特征，这些病毒基因组具有多样性且容易发生基因突变，易形成新的致病毒株，对水禽养殖业造成新的危害。本研究梳理了NDRⅤ的生物学特征、流行病学及诊断方式等，综述如下。

1 生物学特征

1.1 分类学地位

NDRⅤ是新型鸭呼肠孤病毒病的病原，是呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属的一种。其病毒粒子为二十面体对称的球形结构。NDRⅤ是无囊膜结构，具有双层核衣壳的分节段的双链RNA病毒，直径60～80 nm[4]（见图1）。

图1 NDRV（图片摘自https://viralzone.expasy.org/）

1.2 理化特性和培养特性

NDRⅤ病毒粒抵抗力较强，对氯仿、乙醚等不敏感，对3.0%甲醛、0.5%有机碘和热敏感。NDRⅤ接种一般采用卵黄囊接种和绒毛尿囊膜接种这两种方式，其他接种方式在病毒的增殖效果稳定性上不及卵黄囊接种和绒毛尿囊膜接种[5-6]。

1.3 分子生物学特性

NDRⅤ是一种分节段的dsRNA，病毒基因组总大小为23.5 kb。陈仕龙等[7]对NDRⅤ进行核酸节段研究，结果表明，NDRⅤ在SDS-PAG中具有禽呼肠孤病毒的特征：由10个RNA片段组成，包括3个长片段L1、L2和L3，3个中片段M1、M2、M3以及4个小片段S1、S2、S3、S4[8]。与MDRⅤ相比，L片段迁移率大致相同，M、S迁移率均有差异，S1同源性最低，具有高度变异性，差异最大。NDRⅤ的基因组编码14种蛋白，包括10种结构蛋白，在病毒的复制、增殖、感染、传播等过程中具有重要作用[9]。基因组编码蛋白主要功能如表1所示。

表1 基因组编码蛋白主要功能

2 流行病学—临床症状及病理变化

新型鸭呼肠孤病毒病一年四季均能发生，天气炎热潮湿时发病率会上升。NDRⅤ通过垂直传播方式和水平传播方式在诸多品系的鸭中传染，发病率较高。据文献报道，NDRⅤ感染具有明显的年龄依赖性，28日龄以内雏鸭易发，主要以肝脾组织出现坏死性病变为特征，导致免疫抑制，常引起继发感染或混合感染。NDRⅤ感染会引起鸭出血性坏死性肝炎和雏鸭脾坏死症这两种症状，发病日龄相似，但患脾坏死症的雏鸭病程会略长于患鸭出血性坏死性肝炎的雏鸭，其死亡率也高于患鸭出血性坏死性肝炎的雏鸭。大多数成年鸭感染NDRⅤ后无明显临床症状，但后期发现鸭子体重偏轻。由于其水平传播特性，病鸭感染后排毒十余天，其中，3～6天是排毒高峰期[10]。

病鸭的表现为精神沉郁萎靡、乏力，多蹲伏或挤堆，吃料减少或不食，羽毛凌乱无光泽，腹泻，排白色稀粪，少饮嘶叫，甚至出现倒头的现象。病程长短不一，一般为2～14天，在发病后的5～7天内是死亡高峰期。2周龄以内患病鸭死亡率极高，能耐过的病鸭也会发育不良，生长发育变得十分迟缓，成为僵鸭，失去饲养价值[11]。

剖检病死鸭的病理变化主要表现为肝脏略大，肝脏表面出现大量针尖大小的白色坏死灶和大量出血点，质脆[12]；脾脏肿大、斑块状坏死，脾脏出血，有的心脏出血；肾脏和法氏囊出血。武鸿等[13]从病鸭的组织病料中剖检发现，脾脏淋巴细胞数量减少、组织细胞坏死，肝细胞变性。病理组织学变化为肝细胞不同程度地变性或坏死崩解呈局灶性，其间夹杂出血灶并出现大量炎性细胞浸润；肾脏出血水肿，肾小管上皮细胞变性并与基底膜脱离；心脏出现间质性心肌炎，心肌纤维萎缩，间隙增大，并见炎性细胞和出血灶；脾脏出血，淋巴细胞减少、崩解形成坏死灶；法氏囊黏膜下出血，黏膜上皮坏死脱落，淋巴滤泡和淋巴细胞减少[14-15]。

3 诊断方法

3.1 临床诊断

首先，根据患鸭的临床症状判断其是否出现精神沉郁萎靡，吃料饮水减少或不食，多蹲伏或挤堆，羽毛凌乱无光泽，腹泻、排白色稀粪等症状，是否出现倒头现象，是否出现角弓反张等神经症状，判断是否患新型鸭呼肠孤病毒病。其次，对患鸭进行剖检，查看各脏器是否有不同程度的病变且符合上述病理变化特征。根据这些病理的特点，临床上常称其为“鸭新肝病”“鸭出血性坏死性肝炎”“鸭脾坏死病”等[16-18]。

根据临床症状和剖检病理变化可以初步判断患鸭是否患有新型鸭呼肠孤病毒病，然后可通过实验室诊断方法进一步确诊[19]。

3.2 病原学判断

3.2.1 聚合酶链式反应技术（PCR）

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种目前在新型鸭呼肠孤疫病诊断方面应用广泛的分子生物学技术。该方法操作简便、结果表现形式清晰明了，准确度高、灵敏度高，适用于实验室检测。反转录·聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）检测方法可对感染NDRⅤ样品进行快速鉴别诊断，具有重要意义。

3.2.2 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术是在常规RT-PCR反应体系中通过染料法或探针法积累荧光信号与已经制订好的标准曲线比对[20]，实现对监测对象的定量分析，具有高敏感性和定量精确等优点，与常规RT-PCR技术相比，具有快速、灵敏度高、特异性强的特点。

3.2.3 环介导等温扩增技术（LAMP）

环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是在等温（60～65 ℃）条件下，在短时间内完成快速高效的核酸体外扩增技术，且扩增的特异性较高[21]。整个检测过程操作简单，无需凝胶电泳，反应时间较短，用肉眼即可直接观察结果，特别适合基层养殖户的快速检测，同时也为该病的流行病学调查提供了有用工具。

3.3 血清学诊断

3.3.1 琼脂扩散试验

琼脂扩散试验方法快捷、简单，可以应用于大规模流行病学调查，检测时将特异性抗原溶液和抗体放在半固体介质中，让其自由扩散，这时抗原和抗体就会相互结合。若形成一条白色沉淀线，即可判定结果为阳性。李静等[5]通过琼脂扩散试验方法对兴化市100份规模化鸭场的血清进行呼肠孤病毒调查，结果证明，因季节和鸭生长阶段不同，禽呼肠孤病毒流行情况不同。

3.3.2 中和试验

血清中和试验是一种特异性强、敏感性高的血清学监测方法，通过血清与病毒发生中和作用进行鉴别诊断。

3.3.3 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是目前常用的一种血清学监测方法，被广泛应用于各种传染性疾病的诊断和抗体水平的评价，是一种用于NDRⅤ抗体检测的快速、灵敏、特异方法。建立NDRⅤ的ELISA检测方法，能更加快速简便、省时省力地筛检大量样品，可实现筛检样品自动化。ELISA方法的建立为该病的检测奠定了基础，也为试剂盒的研发提供了数据支持。

4 结语

保持水禽养殖业的稳定发展对促进经济发展、改善人民生活、增加出口物资等具有十分重要的意义。近年来，NDRⅤ在我国大面积流行，导致大量水禽养殖场出现鸭脾脏坏死的现象，严重阻碍了水禽业的正常发展。我国不同地区流行的不同呼肠孤病毒株具有宿主差异性、地域差异性及致病性多样化的特征，研究也显示这些病毒基因组具有多样性，病毒的毒力不同，组织亲嗜性、抗原结构、细胞培养特性亦不同，因此，仍需大量研究。目前，人们对NDRⅤ的基因结构与功能研究尚有不足，获得NDRⅤ全基因组序列数据的仅有13株（ZJ00M、J18、091、NP03、TH11、SD-12、SH12、HN5d、DH13、XT18、GX-Y7、DE150、SY），因此，仍需对我国NDRⅤ的流行病学进行调查，丰富NDRⅤ的毒株信息库；对NDRⅤ的特性进行研究，为NDRⅤ疫病的防控和疫苗的研制提供重要材料。同时，目前学者对NDRⅤ致病机制的研究较少，仍需进一步的研究。