广东2020-2021年乙型流感病毒分子变异特征

谭 静，梁丽君，黄 平，黄晓玲，李柏生，曹 虹，邹丽容

510515 广州，南方医科大学公共卫生学院1；511430 广州，广东省疾病预防控制中心广东新发突发传染病防治工作站2

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，历史上曾发生多次世界范围的大流行。根据抗原性不同，人类流感病毒分成甲、乙、丙三型。甲型流感病毒基因易变且易引起流行，乙型流感也常引起局部暴发。近年乙型流感受到全球关注，有研究报道，年龄≥50岁人群乙型流感感染者中，临床病死率可达到2.5% (95%CI，0.7%～7.6%)。

乙型流感病毒基因组具有单负链8个节段，其中血凝素(hemagglutinin，HA)基因位于第4节段，神经氨酸酶(neuraminidase, NA)基因位于第6节段。HA在病毒包膜上以三聚体形式存在，识别并结合宿主细胞表面的受体结合位点(receptor binding sites，RBS)，具有特异性；同时刺激宿主产生保护性中和抗体，是设计流感疫苗的常用靶点。NA由4条糖蛋白链组成，单体头部是NA活性中心，具有型别特异性；此外NA持有神经氨酸酶活性(涉及感染细胞内成熟病毒释放)和抗原性(抗原特异性)。乙型流感8个节段中，以HA和NA基因的生物学功能最为重要，是流感疫情流行的分子基础。

国内山东济宁地区2018-2020年乙型流感Bv毒株流行，属于Bv.1a株系；2021年下半年，广东地区流感疫情频繁，较去年同期每月疫情上升50%～85%。结合本地区的监测工作，初步鉴定为乙型流感活动。为深入了解广东地区2020-2021年乙型流感HA和NA基因的变异和进化特征，本研究开展毒株HA/NA基因分析，以期为乙型流感防治提供分子水平依据。

1 材料与方法

1.1 毒株来源

广东各地区流感监测网络采集流感咽拭并分离流感病毒；时空分布方法筛选流感毒株，其中2020年和2021年分别为8株和26株，合计34株。从GenBank下载全球人类乙型流感毒株的HA/NA基因序列共23对，包括世界卫生组织(World Health Organization，WHO)疫苗株4株，株系代表株5株(2008-2021年)；此外亚洲7株(含中国3株)，欧洲2株和北美5株。

1.2 引物设计与合成

根据2015-2020年全球乙型流感Bv毒株HA和NA基因核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0软件(PREMIER Biosoft International，Palo Alto，CA，USA)设计和兼并，合成HA和NA基因扩增引物各3对。

1.3 基因扩增与鉴定

采用QIAGEN公司QIAamp Viral RNA mini Kit(Lot 169018932)提取RNA，置-20 ℃保存；采用Invitrogen的SuperScript® Ⅲ One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq (Lot 1996333)进行RT-PCR扩增。扩增产物鉴定，Size Marker为100～2 500 bp。

1.4 序列检测

PCR产物纯化采用广州天一辉远基因科技有限公司磁珠法琼脂糖凝胶PCR回收试剂盒，测序用ABI BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit，在ABI 3730 DNA Analyzer上测序。根据顺义和反义引物的测序结果，采用Lasergene v8.1.3软件(DNASTAR，Madison，WI，USA)拼接核苷酸(Nucleotide，Nt)，验证检测序列的正确性。

1.5 变异与进化分析[6]

采用MEGA 7.026软件的Clustal W进行核苷酸同源性分析，用邻接法(Neighbor-joining)构建HA/NA基因进化树。通过BioEdit v7.2.6(Ibis Biosciences，Carlsbad，CA，USA)计算HA/NA上每个氨基酸(Amino acid，AA)位点的熵值(Entropy value)，并进行评价。通过NetNGlyc 1.0 Server对氨基酸序列进行糖基化位点分析。通过Datamonkey 2.0，分别采用SLAC (Single likelihood ancestor counting)、FEL (Fixed-effects likelihood)和FUBAR (Fast，Unconstrained Bayesian App Roximation)方法，对HA/NA基因进行进化分析。

1.6 统计学分析

规整基因序列资料，采用SPSS 23.0对核苷酸和氨基酸变异信息进行独立样本

t

检验。以

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 毒株分布

采用时空分布法筛选2020年(8株)和2021年(26株)毒株(2020年4-12月监测无Bv分离株)，包括潮州5株、东莞1株、广州2株、河源1株、惠州3株、江门2株、茂名2株、梅州1株、清远2株、汕头1株、汕尾2株、韶关5株、深圳3株、湛江1株、中山1株和珠海2株。

2.2 同源性与进化分析

广东Bv毒株HA和NA基因片段，分别为1 875 bp和1 556 bp；编码区(ORF，Open reading frame)分别为1 749 bp和1 401 bp。基因比对发现：①疫苗株B/Colorado/06/2017的HA基因ORF丢失Nt序列(aaaaac)；此后2017年以后的毒株[包括2019和2021年疫苗株(2株)、广东毒株(34株)和全球毒株(14株)]均丢失Nt序列(aaaaacgac)；②以疫苗株B/Brisbane/60/2008的NA基因为基准，其ORF共有1 401 bp，在Nt后插入tcc，出现在B/Bangladesh/8007/2021和B/Singapore/WUH7588/2021毒株。

以4株疫苗株基因序列作为基准，计算2020年和2021年广东毒株的核苷酸同源性，结果如表1所示。同源性分析揭示：①4株疫苗株中，广东2021年流行毒株HA基因同源性与疫苗株B/Austria/1359417/2021同源性最高[(99.19±0.26)%]，而NA基因同源性却与2019年疫苗株B/Washington/02/2019同源性却最高[(99.23±0.11)%]；②以4株疫苗株HA核苷酸序列为基准，2021与2020年毒株HA基因均有统计学差异(

P

<0.01)，提示广东2021年毒株HA基因发生极其明显变异；③以疫苗株B/Washington/02/2019的NA核苷酸序列为基准，2021年毒株与2020年毒株NA基因同源性有统计学差异(

P

<0.01)，提示广东2020年毒株NA基因有明显变异；④疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA基因与2021年毒株HA基因同源性为(99.19±0.26)%；而与2021年下半年毒株(17株)HA基因同源性高达(99.28±0.25)%，提示广东2021年下半年流行毒株HA基因与当前WHO推荐疫苗株基因依然高度契合。

广东2020-2021年的34株毒株HA基因进化特征，如图1A所示，结果显示：①广东2020年毒株(8株)与广东2021年毒株(下半年分离，17株)具有不同基因特征：2020年毒株呈Bv.1a.3株系特征，2021年毒株主要呈Bv.1a.3a.2株系特征。；②广东2020年毒株与2021年毒株(上半年，9株)具有疫苗株B/Washington/02/2019基因特征；国外2020年毒株包括欧洲(圣彼得堡)、美洲(加州和宾州)、亚洲(新加坡、爱知)和2021年美洲毒株(德州和新墨州)；③广东2021年毒株(下半年分离)呈现疫苗株B/Austria/1359417/2021基因特征，具体表现国外是B/Paris/9867/2020最早出现(2020-11-25)，随后是国内广东B/Guangdong/073/2021 (2021-01-02)，北京B/Beijing/Chaoyang/12099/2021 (2021-08-31)；另包括国外(密歇根、孟加拉和新加坡)2021年1月后的分离毒株。

广东毒株NA基因进化如图1B所示，主要特征包括：①广东2020年毒株(8株)与2021年(26株)具有不同基因特征，广东2020年毒株NA基因与同期圣彼得堡、加州、新加坡、宾州、爱知、中国香港的毒株同源性类似；②广东2021年上半年毒株(1～6月，9株)与下半年部分毒株(17株)也具有一定差异；③广东2021年26株NA基因相似度更接近疫苗株B/Washington/02/2019的基因(99.23±0.11)%。

2.3 氨基酸和抗原位点置换

HA基因ORF的1 749 bp编码582个氨基酸(AA)；以疫苗株B/Washington/02/2019的HA基因为基准，50株中，31个氨基酸位点发生置换，其中广东34株毒株有26个置换，全球14株(2020-2021年)有16个置换，疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA基因有8个置换。以疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA基因为基准，广东和全球毒株置换差异一致。

以疫苗株B/Washington/02/2019的HA基因为基准，置换位点包括位点HQ/N(广东，16/26；全球，1/6)、位点SD/N(广东，7/8和广东，26/26；全球，8/8和全球，6/6)、位点AT、PL和KR(广东，15/26；全球，1/8和全球，4/6)、位点RG、GE和RK(广东，26/26；全球，2/8和全球，4/6)、位点VM和PQ(广东，10/26；全球，1/8和全球，4/6)。

疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA基因特征在于，位点AT、RG、PL、GE、SD、KR和RK已经发生置换；即在这些位点上，疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA氨基酸序列已体现出广东2021毒株特征。比较广东2021年下半年毒株与疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA基因差异，在于KE(2/19)以及TI、PLSS、AT和GR(1/19)置换。

疫苗株B/Washington/02/2019的NA基因ORF具有1 401 bp，编码466个AA；以此NA基因为基准，AA后插入亮氨酸(L)见于B/Bangladesh/8007/2021和B/Singapore/WUH7588 /2021毒株。50株中，共29个AA位点变异，其中广东(34株)和全球(14株)分别有14和20变异位点；此外，疫苗株B/Austria/1359417/2021的6个位点变异。

以2019年疫苗株NA基因为基准，变异特点包括：①广东2020年毒株仅EG变异；②2021年毒株包括DN(13/26)、NS(13/26)、GE/R(14/26)、VI(13/26)和KE(15/26)；以及DN、NS、GE、VI和KE；③少数基因变异还包括FL、IM、PQ、PT、VI、IV、GE和ED。

表1 广东毒株HA/NA基因同源性比较(%)

HA (x±s)NA (x±s)疫苗株2020年(n=8)2021年(n=26)P2020年(n=8)2021年(n=26)PB/Brisbane/60/200897.76±0.0997.43±0.16<0.00198.44±0.0998.47±0.090.464B/Colorado/06/201798.75±0.0798.45±0.17<0.00199.14±0.0999.17±0.090.448B/Washington/02/201999.81±0.0698.90±0.21<0.00199.79±0.0899.23±0.11<0.001B/Austria/1359417/202198.50±0.0599.19±0.26<0.00198.44±0.0998.54±0.150.072

基因核苷酸(ORF)同源性是基于广东毒株与疫苗株的比较

A:HA基因；B:NA基因

2.4 糖基化位点与药敏位点变异

疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA蛋白共有潜在糖基化位点10个，即NVT、NCT、NIT、NKT、NQT、NKS、NGT、NIT、NHT和NVS。此次变异中，HA氨基酸DN变异，导致增加糖基化位点NET，见于B/Guangdong/428/2020、B/Guangdong/523/2020和B/Guangdong/053/2021；PLSS变异，增加NSS糖基化位点，见于B/Guangdong/116/2021。疫苗株B/Austria/1359417/2021的NA蛋白共有潜在糖基化位点4个，NAS、NRS、NGT和NKT；未发现置换变异。

以疫苗株B/Brisbane/60/2008的NA为基准，已报道NA单耐药位点共有29个和双耐药位点4个；在本研究中未出现上述具体氨基酸位点变异。

2.5 熵值和选择性改变

根据50株毒株HA氨基酸熵值结果，熵值≥0.600包括位点148、165和291(均为0.641)， 142、159和215(均为0.680)，137(0.717)，196(0.731)和209(0.779)；NA氨基酸包括位点344(0.680)和234(0.684)。见表2。

50株HA和NA基因，进行选择性分析(NA未计入插入L，见B/Bangladesh/8007/2021和B/Singapore/WUH7588/2021)。SLAC和FEL两方法中к<к，而FUBAR方法中к>к，提示不同计算方法导致HA基因的к值[转换(α)/颠换(β)]不同。SLAC检验ω=d/d比值，如果ω<1，且

P

(ω<1)<0.1则存在负向选择位点，SLAC检验分别位于HA基因73，138，437和497位点和NA基因179，321和335位点。

50株毒株采用FEL检验，选择性分析显示，HA和NA基因分别筛选出28个和14个负向选择位点；采用FUBAR检验，分别筛选出HA基因15个负向选择位点和1个正向选择位点(AA)，NA基因10个负向选择位点和1个正向选择位点(AA)。根据多种方法结果一致性的原则，综合评价，HA和NA基因氨基酸负向选择位点分别是73，138，437和497位点，及179，321和335位点。

3 讨论

自2009年流感H1N1出现以后，广东流感各型别(包括HN和B型)共同存在流行季节中，交替成为优势型别。本研究中，①2020-2021年流感优势毒株被鉴定为B型Victoria株系；②2020年4-12月监测未分离到流感各亚型毒株，这可能与流感流行特征以及国内新冠疫情的严格防控措施有关系；③2021年下半年Bv毒株多从局部疫情暴发人群中分离。

分别以4株疫苗株HA基因为基准比较广东2020与2021年毒株之间差异，发现4株疫苗株的基准的2年间HA基因同源性均有统计学差异(

P

<0.01)，NA基因在2020年(与2020年前比较)也发生变异，但仅与B/Washington/02/2019基准差异明显，提示广东Bv流行株HA基因在2021年(与2020年比较)发生显著性变异。而且广东Bv流行株HA基因变异特征，主要呈现于2021年下半年的疫情毒株。杭州2014-2019年流行Bv的Bv.1a株系(类似疫苗株Bv/Colorado/06/2017)，HA和NA基因同源性分别为94.67%和97.13%。

此次广东毒株变异(以疫苗株B/Washington/02/2019的HA基因为基准)见于A表位[VI (1/26，202 1)、HN/Q (16/26，2021)、AT(15/26，2021)；RG(26/26，2021)]、B表位[GR(1/26，2021)、PL (15/26，2021)；NK(26/26，2021)]；D表位[SN(7/8，2020)、SD(25/26，2021)；TA(5/8，2020)]。与此比较，杭州Bv.1a株系毒株变异见于A表位(LI、HN、IV)、B表位(ND/G、GR)和D表位(IV)；云南地区2017-2018年流行乙型流感By/Bv毒株，其中Bv毒株HA基因具有VI突变特征，同时SN和VI发生变异。

表2 50株毒株HA/NA基因熵值

氨基酸位点a熵值HANA<0.30014, 88, 95, 125, 141, 143, 155, 174, 182, 184, 185, 194, 268, 71, 156, 519, 245, 21412, 16, 45, 51, 70, 73, 80, 119, 263, 360, 372 , 400, 406, 460, 75, 76, 107, 249, 314, 379, 385, 284<0.600211, 560, 232, 25353, 59, 304≥0.600148, 165, 291, 142, 159, 215, 137, 196, 209344,234

a：基于疫苗株B/Washington/02/2019的基因序列

与2019年和2021年疫苗株HA基因比较，广东2020年毒株呈Bv.1a.3株系特征，2021年毒株主要呈Bv.1a.3a.2株系特征，但变异幅度更大。WHO已于2021年9月更换疫苗组Bv毒株为B/Austria/1359417 /2021，与该疫苗株比较，2021年广东株在表位和RBS区域变异包括HQ/N、RG和PQ。以疫苗株B/Washington/02/2019的NA基因为基准，2021年广东毒株NA基因5个氨基酸(DN、NS、GE/R、VI和KE)发生明显变异(50.0%～57.7%)。此变异幅度既超越疫苗株B/Austria/135941 7/2021 (2021-10 -09，仅KE)，也超越2021年上半年的北京毒株B/Beijing/Chaoyang/12099/2021(2021-08-31，仅DN、NS和GE)。

10个HA和4个NA基因潜在糖基化位点，经分析均无明显变异趋势。NA基因已知药物敏感位点未发现变异。基因氨基酸位点的熵值反映该位点变异频率。本研究中，50株毒株的HA和NA分别存在9个(148/165/291/142/159/215/137/196/209)和2个(344/234)易突变位点。

由于流感病毒缺乏RNA聚合酶校对功能，HA和NA基因易发生点变异，常使用错义替代与同义替代的比值(d/d)评估氨基酸位点所受的自然选择压力。当d/d>1时，表示该位点为正向选择位点；d/d=1时，该位点为中性进化不受选择；d/d<1时，则表示该位点为负向选择位点。本研究中，50株Bv经SLAC、FEL和FUBAR 3种方法均筛选出HA和NA基因存在负向选择位点，分别位于73，138，437和497位点，及179，321和335位点。此次筛选出的负向选择位点，提示乙型流感病毒Bv毒株HA和NA基因在广东地区的自主变异进化明显，已超越免疫压力因素的作用。

在人类流感病原体中，甲型流感病毒(H1N1、H3N2)的HA/NA基因表现变异频繁，通常存在基因正向选择位点。此次广东Bv毒株出现多个氨基酸的负向选择位点，在流行病学和基因进化中的意义有待于进一步探讨。然而，结合流感疫情现状，同时关联核苷酸/氨基酸的同源性比较、抗原表位的变异、负向选择位点筛选，可以推断广东乙型流感Bv毒株具有引发流感局部/洲际疫情的流行病学意义。总之，本研究提示，①Bv毒株分子(HA等)变异是导致广东2020-2021年流感局部暴发的原因；②2021年下半年的流感进一步变异，可能引起2022年Bv毒株局部流行；③尽管WHO的2021年9月推荐的疫苗株依然有效，但广东2021年Bv毒株的变异，提示WHO应考虑更新疫苗株的可能性。