抗除草剂大豆GE-J12实时荧光定量PCR检测方法的建立

曹英芳 赵新 刘双 李瑞环 刘娜 徐石勇 高芳瑞 马卉兰青阔 檀建新 王永

（1.河北农业大学食品科技学院，保定 071001；2.天津农业科学院种质资源与生物技术研究所，天津 300381；3.安徽省农业科学院水稻研究所，合肥 230041）

大豆是一种理想的优质植物蛋白食物［1］，是食品和饲料中蛋白质的重要来源［2-3］，在我国膳食结构［4］中占有重要地位。近年来，全球大豆的需求量呈上升趋势［5］，预计未来大豆需求量将持续上升。我国转基因大豆研发起步较晚，但其种植面积约占总转基因作物种植面积的50%［6-7］，发展前景巨大。转基因产品的研究与产业化是农业科学技术高速发展的重要组成部分［8］，随着转基因技术的飞速发展［9-10］，转基因作物及其衍生食品的安全问题［11-12］受到人们的关注。我国建立了符合国情并与国际接轨的农业转基因生物安全标准体系［13］，对转基因实施定量标识管理制度，为我国农业转基因生物安全管理提供了有力的技术保障［14］，因此亟需建立快速、精准的转基因成分定量检测方法。

目前国内外转基因食品检测技术主要以蛋白质和核酸检测为主。蛋白质在加工中易丧失抗原活性，所以蛋白质检测方法对于转基因初产品较为适用。以核酸检测为主的环介导等温扩增技术引物的设计要求较高，耗材昂贵；普通PCR技术只能定性检测转基因食品；数字PCR技术耗材昂贵；基因芯片技术成本高、数据分析复杂；而实时荧光PCR技术可用于转基因食品检测的定性或定量检测，具有快速、灵敏、准确、污染少等优点，且在转基因产品检测上已得到广泛应用。荧光PCR技术是在聚合酶链式反应技术的反应体系中加入荧光物质［15］，通过采集到的荧光信号与拷贝数关系［16］，生成可视化的曲线，实时监测整个反应过程［17］，实现了从定性到定量的飞跃［18］。本研究采用的TaqMan水解探针法，与普通PCR技术相比，该方法主要用作转基因检测的定量分析，从而来确定基因转录水平，也可用作转基因检测的定性分析［19］。根据转化体和内标基因特异性序列设计引物和TaqMan探针，对标准品和试样同时进行实时荧光PCR扩增。根据标准样品模板拷贝数与Ct值之间的线性关系，分别绘制转化体和内标基因的标准曲线。通过转化体和内标基因拷贝数比值确定转基因含量。

GE-J12是中国农业科学院研发的转G2-EPSPS基因和GAT基因的抗除草剂转基因大豆新品系，对除草剂草甘膦具有较高的耐受性。目前，国内外还未见到抗除草剂大豆GE-J12的实时荧光定量PCR的定量检测。本研究根据抗除草剂大豆GE-J12品系外源基因插入位点5'端转化体特异性序列设计引物和探针，经特异性、准确度、精密度和重复性测试，确定方法的检测极限和定量极限，以期建立转G2-EPSPS基因和GAT基因的抗除草剂大豆GE-J12品系的定量检测方法，为农业转基因生物安全评价和产权保护提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 试验所用转G2-EPSPS基因和GAT基因抗除草剂大豆GE-J12及其受体材料Jack由中国农业科学院提供；其他转基因大豆、转基因玉米、转基因油菜、转基因水稻、转基因棉花、其他非转基因大豆混样均购置于农业农村部科技发展中心。

1.1.2 主要试剂 TIANGEN高效植物基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；TaKaRa 2×Premix Ex Taq（probe q PCR），购自TaKaRa；其他试剂（分析纯），购自TaKaRa。

1.1.3 仪器设备 BIO-RAD CFX96实时荧光PCR仪，购自BIO-RAD；ND-1000紫外可见分光光度仪，购自基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 随机取GE-J12和受体Jack的种子各100粒，研磨混匀，取100-200 mg，应用TIANGEN高效植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA。获得的基因组DNA，经ND-1000紫外可见分光光度仪，检测DNA质量，所有基因组DNA的OD260/OD280在1.8-2.0之间，浓度在50 ng/μL-100 ng/μL 之间。

1.2.2 引物设计 根据抗除草剂大豆GE-J12品系外源基因插入位点5'端转化体特异性序列设计引物和探针，具体信息见表1，引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物和探针Table 1 Primers and probes used in this study

1.2.3 特异性检验 分别以1.1.1中材料提取并稀释到25 ng/μL的DNA为模板，应用实时荧光PCR常用反应体系和程序，对设计的引物探针进行实时荧光PCR扩增，每个反应设置3个平行，测试引物探针特异性。

1.2.4 引物浓度和体系反应程序优化 设置52、54、56、58、60和 62℃共 6个退火温度和 0.10、0.20、0.25、0.30、0.40和0.50 μmol/L共6个引物浓度，进行实时荧光PCR扩增，选择扩增曲线峰型成“S”型且扩增效率较高的曲线，确定退火温度和引物浓度。

1.2.5 标准曲线构建 将提取的转基因大豆GE-J12基因组DNA（25 ng/μL）稀释至20%、4%、0.8%、0.16%、0.032%、0.006 4%进行PCR扩增。利用7个浓度梯度的DNA（含100%）为模板进行实时荧光PCR扩增，构建转基因大豆GE-J12特异性序列标准曲线，以实现对转基因大豆GE-J12的相对定量分析。

1.2.6 准确度、精确度和重复性测试 GE-J12大豆和其受体材料粉末按照5%、3%、1%的质量百分比进行混合，采用 1.2.4中建立的优化后的反应体系和程序进行实时荧光定量PCR检测。每次设3个平行，通过多次测试的测量值与真实值之间符合程度和测量值之间的符合程度，评价测试方法的准确度和精确度。

1.2.7 检测极限和定量极限测试 根据农业部2259号公告-5-2015的规定，转基因检测方法的检测极限（LOD）应不高于目标浓度的1/20，定量极限（LOQ）应不高于目标浓度的1/10。根据1.2.5中的扩增结果数据分析得出LOD和LOQ。

2 结果

2.1 特异性测试

只有以GE-J12 DNA为模板时，出现典型扩增曲线，以大豆受体Jack、其他转基因大豆、转基因玉米、转基因油菜、转基因水稻、转基因棉花和其他非转基因大豆混样为模板时，均未出现典型扩增曲线，如图1，表明本检测方法的特异性良好。

图1 实时荧光定量PCR特异性检测结果Fig.1 Specific detection results via real-time fluorescence quantitative PCR

2.2 引物浓度和体系反应程序优化

退火温度在58℃条件下，扩增曲线呈“S”型，荧光信号值最高，确定退火温度为58℃，如图2。图中3号和4号的扩增曲线Ct＜36，根据经济原则选择3号，确定引物和探针终浓度分别为0.5 μmol/L和 0.25 μmol/L。

图2 实时荧光定量PCR体系优化结果Fig.2 Optimization results of real-time fluorescent quantitative PCR system

2.3 标准曲线构建及线性度

本方法在模板含量为0.006 4%-100%范围内线性度为0.992，扩增效率为101.5%，如图3。

图3 标准曲线建立Fig.3 Standard curve establishment

2.4 准确度、精确度和重复性测试

通过转基因大豆GE-J12转化体特异性序列和内源基因Lectin的拷贝数的lg值的比值，对5%、3%和1%样品进行定值，测试结果与真实值平均偏差为2.87%、6.87%、16.67%，均≤25%，符合定量方法建立要求，具体结果如表2。

表2 样品定值结果Table 2 Results of sample setting

2.5 定量限和检出限测试

以模板含量为0.032%和0.006 4%扩增时，均有典型扩增曲线，其中模板含量为0.006 4%时，18次扩增有14次出现扩增曲线。所以采用0.032%模板含量，进行了60次重复试验，Ct值的平均值为34.95，最大值为35.50，最小值为34.40，确定本检测方法的检出限LOD为0.032%，如图4。

图4 转基因大豆GE-J12实时荧光定量PCR检出限测试Fig.4 Detection limit via real-time fluorescence quantitative PCR for genetically modified soybean GE-J12

分别以0.16%和0.032%的DNA为模板，进行了3次重复扩增试验，SD值分别为0.14-0.20和0.37-0.67，RSD值分别为0.43%-0.59%和1.04%-1.89%，随着模板浓度的降低，扩增结果Ct值的SD和RSD增大。确定本检测方法的定量限LOQ为0.16%，具体结果如表3。

表3 实时荧光定量PCR灵敏度及可重复性测试Table 3 Sensitivity and repeatability test of real-time fluorescence quantitative PCR

3 讨论

一般通过检测外源基因，判断其是否为转基因食品。目前，普通PCR技术可用于转基因定性检测，实时荧光定量PCR技术可用于转基因定量及定性检测，数字PCR技术可用于转基因检测的定量检测。李瑞环等［20］建立了转基因耐除草剂大豆ZH10-6多重PCR检测方法，该方法易造成交叉污染、假阳性，并且存在灵敏度不高、操作繁琐和特异性低、耗时耗资、不能定量检测等缺点。冀志庚等［21］采用SYBR Green实时定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数，该方法不具有特异性，反应中的引物二聚体或非特异性扩增也会发生荧光。邢珍娟等［22］建立了二重荧光PCR检测转基因成分方法用于转基因成分筛查；汪小福等［23］建立的实时荧光PCR技术对转基因玉米进行检测，均为基于TaqMan探针法的实时荧光PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高，操作简便，能够克服普通PCR的缺点，实现对转基因成分的定量分析。

通过对多重PCR技术、SYBR Green实时定量PCR技术和TaqMan探针法的实时荧光PCR技术比较发现，最后一种方法对转基因检测更适合，且在转基因定量检测中应用广泛。实时荧光PCR技术和数字PCR方法是目前被国际认可的主要转基因成分定量检测方法。Košir等［24］对大豆内标基因和外源基因建立数字PCR技术进行单重和双重方法。本研究后续针对转基因大豆GE-J12将建立基于数字PCR技术的绝对定量，此技术可实现绝对定量，具有更高的灵敏度，无需标准品，不需要通过建立标准曲线来定量，操作更加简便，应用前景广泛。

转基因大豆GE-J12是中国农业科学院研发的转基因大豆新品系。当前国内外文献还未见到抗除草剂大豆GE-J12的实时荧光定量PCR的定量检测。本研究采用的基于TaqMan探针法的实时荧光PCR技术对转基因大豆GE-J12进行定量检测，试验结果均符合2259号公告-5-2015的规定。该方法可用于转基因耐除草剂大豆GE-J12转化体特异性序列含量的精准定量，为大豆GE-J12的检测提供了新方法；为该转基因大豆品系商品化后，转化体的安全评价、行政监管和知识产权保护提供重要的技术支撑。

4 结论

本研究建立了基于TaqMan法的转基因大豆GEJ12实时荧光定量PCR检测方法，确定了上、下游引物和探针的浓度分别为0.5 μmol/L、0.5 μmol/L和0.25 μmol/L，退火温度为58℃，在RSD小于25%的情况下检出限为0.032%，定量限为0.16%，线性度为0.992。