AOX基因家族的结构和功能特征分析

王慧 马艺文 乔正浩 常彦彩 术琨 丁海萍 聂永心 潘光堂

（1.四川农业大学玉米研究所，成都 611130；2.通化市农业科学研究院，通化 135007；3.山东农业大学作物生物学国家重点实验室，泰安 271018）

交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）广泛存在于真菌、原生生物以及高等植物中［1］，1987年首次从枯苞（Sauromatum guttatum）中分离出AOX，随后在拟南芥、烟草、黄瓜、葡萄、玉米、大豆、水稻等多个物种中均发现了AOX基因，且以家族形式存在［2］。系统发育分析表明，AOX属于二铁羧酸氧化酶，来源于一种原始氧化还原酶，该酶能够清除地球生命发生早期处于高度还原状态的大气中氧气［3］，随着长时期的共生进化，演化为线粒体中的AOX 酶［4-7］。

前人研究表明，AOX参与了植物线粒体内膜呼吸链中的抗氰呼吸途径，具有抗氰化物活性，因此又被称为抗氰氧化酶［8］。AOX不仅在维持植物正常生长代谢速率和代谢平衡中发挥了重要作用［9］，而且还在抑制自由基产生，植物抵御逆境胁迫中发挥着重要作用［10］。Wanniarachchi等［11］分别对水稻和大麦进行盐胁迫和干旱胁迫处理后，AOX1a和AOX1d表达水平显著增强。Wang等［12］对拟南芥进行低温胁迫处理后，AOX1a和AOX1c的表达量显著增加。Panda等［13］对烟草进行铝胁迫处理后，发现AOX在铝胁迫耐受中起关键作用，具有增强呼吸能力、减少线粒体氧化应激负担和提高烟草细胞生长的能力。此外，在镉、铬环境下，烟草、槐叶萍［14］和拟南芥［15］中AOX的转录和翻译水平同样均有所提高。Liao等［16］将番茄叶片接种烟草花叶病毒（TMV）后，SlAOX1a的转录水平显著增强，提高了对TMV的抵御能力。大量研究报道均证实了在植物体受到干旱、盐碱、温度、光照、重金属等非生物胁迫时，AOX在响应这些逆境胁迫中发挥了重要作用［11，17-23］。

为了进一步探究AOX的生理功能及其基因家族的基本特征，本研究针对玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、番茄（Solanum lycopersicum）、马铃薯（Solanum tuberosum）、高粱（Sorghum bicolor）和大豆（Glycine max）8个物种，利用生物信息手段，开展了AOX基因家族的进化、基因结构、保守基序、顺式作用元件和功能注释等系列分析工作。玉米（Zea mays L.）是重要的粮食、饲料、能源和工业原料作物，同时也是当今世界上种植面积最大的禾谷类作物，在保障我国国民经济发展和国家粮食安全中发挥了不可估量的作用［24］。目前关于玉米中AOX基因家族的生理功能鲜有报道，因此，本研究开展了玉米与其他7个物种AOX基因家族的共线性分析，同时对玉米自交系B73苗期进行了高温、低温、干旱、盐碱胁迫处理，拟通过对玉米AOX基因家族表达模式的分析，为进一步挖掘AOX基因家族在玉米应对非生物胁迫中的功能解析提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取玉米自交系B73为供试材料，种子经消毒后置于装有营养土的苗钵中，在昼夜温度为28℃/25℃，光暗周期为 14 h /10 h，相对湿度为70%的人工气候培养箱中培养至三叶一心期时进行干旱（20% PEG6000溶液）、盐碱（200 mmol/L NaCl+25 mmol/L Na2CO3）、高温（40℃）、低温（4℃）分别处理0、2、4、6、12和24 h。采集对照组与所有处理组根、茎、叶（均为3次重复），液氮速冻后，转移至-80℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 AOX基因家族的鉴定 通过Ensembl Plant数据库（http://plants.ensembl.org/index.html）查找玉米、水稻、拟南芥、二穗短柄草、番茄、马铃薯、高梁和大豆的蛋白序列、CDS、genome、GFF、cDNA、GTF文件。从Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）内下载植物AOX基因家族的HMM模型（PF0178）后，通过Hmmsearch鉴定各个物种中AOX基因家族的成员，将搜索阈值设为E ＜ 1e-5，筛选出具有AOX结构域的蛋白序列。利用植物转录因子数据库 PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）、HMMER v.3.2.1（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan）和Pfam数据库进一步验证蛋白序列，整合上述结果，进而得到8个物种中鉴定到的非冗余蛋白序列。利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）估算AOX蛋白序列的分子量（Mw）、理论等电点（pI）、GRAVY、不稳定性指数（II）。同时，将获得的序列提交至CELLO网络服务器（http://cello.life.nctu.edu.tw/）进行AOX蛋白的亚细胞定位预测。

1.2.2 多序列比对和系统发育分析 使用ClustalX v.1.83（默认参数）对玉米、水稻、拟南芥、二穗短柄草、番茄、马铃薯、高梁和大豆8个物种AOX蛋白序列进行多重序列比较，利用MEGA X将比对后的序列构建无根系统进化树，根据进化关系对系统进化树进行分组。

1.2.3 基因结构和保守基序分析 从基因组注释文件中获取玉米、水稻、拟南芥、二穗短柄草、番茄、马铃薯、高梁和大豆8个物种AOX基因内含子-外显子结构，递交到基因结构显示服务器GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/），并对所获得的结果进行统计分析。利用在线网络服务器MEME（http://memesuite.org/tools/meme）识别AOX蛋白中所包含的保守基序（设置：最佳的motif 8，motif长度6-50，其它参数默认）。

1.2.4 共线性分析 不同物种基因之间的共线性分析，可以为研究物种进化关系提供参考依据。利用MCScanX鉴定玉米与其它7个物种（水稻、拟南芥、二穗短柄草、番茄、马铃薯、高梁、大豆）之间AOX的同源基因，同时利用Circos0.67工具可视化玉米与上述物种AOX基因之间的共线性关系。利用PAML软件包的codeml程序计算Ka/Ks比值，Ka/Ks≤ 1表示纯化选择作用，Ka/Ks ＞ 1表示正向选择。进化时间计算公式为T =（Ks/2λ）×10-6Mya，（λ =6.5×10-9）。

1.2.5 顺式作用元件和miRNA靶位点预测 在玉米、水稻、拟南芥、二穗短柄草、番茄、马铃薯、高梁和大豆8个物种的基因组文件中获得转录起始位点上游1.5 kb序列，递交到PlantCARE数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）开展顺式作用元件的鉴定工作。将8个物种AOX的cDNA序列提交至psRNATarget（http://plant grn.noble.org/psRNATarget/），搜索miRbase中所有的玉米miRNA，进而识别候选miRNA靶标。

1.2.6 AOX蛋白质的GO注释分析 将玉米、水稻、拟南芥、二穗短柄草、番茄、马铃薯、高梁和大豆8个物种中的AOX蛋白序列提交至KOBAS数据库（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1），进行AOX蛋白的GO（gene ontology）注释分析，整合预测后获得的GO号一一对应到AOX基因中。将每个基因获得的GO号提交至在线WEGO（https://wego.genomics.cn/），使用默认参数对AOX基因GO注释分析进行可视化。

1.2.7 非生物胁迫条件下玉米AOX基因家族的表达分析 RNA的提取和cDNA的合成分别采用东盛生物核酸纯化试剂盒、康为世纪反转录试剂盒，并严格按照说明书进行操作完成。定量引物通过NCBI网站设计后，由青岛擎科生物技术有限公司合成（表1）。以玉米18S基因作为内参，通过荧光定量PCR分析玉米AOX基因家族在4种胁迫处理中的表达情况。采用艾科瑞生物的SYBR®GREEN Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（含ROX）进行荧光定量PCR扩增，扩增反应使用山东农业大学作物生物学国家重点实验室ABI Quantitative PCRQ6-1荧光定量PCR仪。获得定量数据后，使用Excel、Prism软件和R-pheatmap包进行数据分析和作图。

表1 引物序列Table1 Prime Sequence

2 结果

2.1 AOX基因家族的鉴定

本研究在8个物种中共鉴定出35条编码AOX蛋白保守结构域的基因，其中在玉米、水稻、拟南芥、二穗短柄草、番茄、马铃薯、高粱和大豆中分别鉴定到4、4、5、5、3、6、4和4个AOX基因。8个物种中AOX蛋白的理化性质分析结果如表2所示，玉米、水稻、拟南芥、二穗短柄草、番茄、马铃薯、高粱和大豆的AOX基因分别主要分布在2号、2号和4号、3号、5号、8号、8号、6号、8号染色体上，具有成簇分布的特征。在这8个物种中，AOX蛋白的大小变异范围为174-753 aa，平均长度为353 aa。AOX蛋白的分子质量变异范围为19.68-85.44 kD，等电点pI值介于5.44-9.49。GRAVY值介于-0.38-0.02，除StAOX_PGSC0003DMT400019710之外，其他AOX蛋白具有负重力值，表明AOX蛋白具有亲水特性。通过对AOX蛋白的亚细胞定位预测，发现有24个AOX主要在细胞质中表达，占总数的68.57%，其余11个AOX基因在周质空间表达。

表2 8个物种AOX基因家族的鉴定及理化性质Table 2 Identification and characteristic features of AOX gene family in eight species

2.2 系统进化树

将本研究鉴定到的35个AOX蛋白序列以邻接法构建无根系统进化树，根据系统进化关系，35个AOX蛋白可划分为5个亚家族（图1）。不同亚家族包含的AOX蛋白数量变化很大，D亚家族拥有最多数目的AOX（10个），其次是E亚家族（8个），而C家族仅有3个蛋白质，是最小的亚家族。每个分支都包含至少2个物种AOX蛋白，表明这些物种的AOX蛋白是由共同祖先进化而来，并且在每个物种中都能够独立扩张。玉米的AOX基因主要分布在A、B亚家族，且这两个亚家族中包含水稻、二穗短柄草、高粱的AOX基因，表明玉米与水稻、二穗短柄草和高粱有较近的亲缘关系。

图1 8个物种AOX基因的系统进化树Fig.1 Phylogenetic analysis of AOX in eight species

2.3 基因结构

外显子-内含子结构变异是研究基因家族进化的重要依据。本研究35个AOX基因的外显子数目为1-13个，外显子长度介于22-677 bp，平均长度为258.74 bp。内含子长度变化显著高于外显子，介于46-5 874 bp，平均长度为375.07 bp。E亚家族外显子平均数目最多，4.85个外显子；其次是D亚家族，平均含有4.8个外显子。D亚家族是最大的亚家族，外显子数目变异范围大，拥有较高丰度的内含子数目，同时其基因结构比其它亚家族更为复杂。在系统进化树中，位于相同亚家族的成员具有相似的外显子-内含子结构（图2）。

由35个AOX蛋白保守结构域鉴定结果（图2）表明，共预测到了8个基序，其中基序1、2、3在35个AOX蛋白质中均预测到，基序1和基序8分别位于N端和C端。聚集在同一个亚家族中的AOX蛋白更有可能具有相同的基序组成，表明相同亚家族的成员具有相似的进化历程和生物学功能。

图2 AOX基因家族的系统进化关系、基因结构和保守基序分析Fig.2 Phylogenetic relationship，gene structure，and conserved motifs analysis of AOX

2.4 共线性分析

玉米与其它7个物种AOX基因的共线性关系分析结果（图3）表明，玉米与拟南芥、水稻、高梁、二穗短柄草、番茄、大豆、马铃薯的AOX同源基因分别为1、3、4、4、1、2、2个。Ka/Ks表示非同义替换位点替换次数（Ka）与同义替换位点替换次数（Ks）的比值，可以推断基因发生复制的时间和受到的进化压力。所有同源基因比对的Ka/Ks的值均小于1，表明AOX基因在进化过程中受到强烈的纯化选择压力（表3）。

表3 玉米AOX和其他7个物种之间直系同源AOX蛋白的Ka / KsTable 3 Ka/Ks for orthologous AOX proteins between Z.mays and other seven species

图3 玉米与其他物种AOX基因的共线性分析Fig.3 Collinearity of AOX genes between maize and other species

2.5 顺式作用元件和miRNA靶位点预测

本研究顺式作用元件鉴定结果如图4所示，在35个AOX基因中鉴定到1 215个调控元件与昼夜节律相关，其中大量顺式作用元件与植物生长调控、不同组织和时期的特异性表达、激素响应、光响应和非生物胁迫响应等相关。本研究共鉴定到43个功能性顺式调控元件，其中参与细胞周期调控的MSA-like调控元件仅在2个基因中发现。在多数AOX基因中发现ABRE（响应ABA，27个基因）、CGTCA-motif（响应 MeJA，28个基因）、TGACG-motif（响应MeJA，28个基因）和G-box（响应光，6个基因）等作用元件。此外，还发现了多个响应胁迫的调控因子：在35个AOX基因中鉴定到62个伤口响应相关的WUN-motif，7个AOX基因中鉴定到9个响应低温胁迫的LTR调控元件，16个AOX基因中鉴定到20个与干旱胁迫相关的MBS作用元件。通过顺式作用元件鉴定发现，AOX基因在调控多种应激响应和信号转导过程中具有潜在功能。

图4 AOX基因启动子区域顺式调节元件分析Fig.4 Characterization of cis-acting regulatory elements in the promoter region of these identified AOX genes

miRNA是一类内源性非编码RNA，大小为21-25个核苷酸，它们通过引导靶标mRNA的裂解或抑制mRNA翻译，在转录后控制基因表达。本研究miRNA靶位点预测结果如表4所示，共发现11对miRNA-AOX相互作用组合，其中涉及到8个miRNA靶向作用的11个AOX基因。在11对相互作用模式中，其中有4个miRNA通过裂解转录使AOX基因沉默、7个miRNA通过抑制mRNA翻译靶向作用于AOX蛋白。

表4 psRNATarget在线工具鉴定靶向作用AOX基因的假定miRNATable 4 List of putative miRNAs targeted AOX genes identified by psRNATarget online tool

2.6 AOX蛋白的GO注释

GO（gene ontology）具有包括细胞成分（cellular component）、生物过程（biological process）以及分子功能（molecular function）在内的3个相对独立部分，可以实现与基因相关的数据库转化、挖掘与整合。本研究共注释到45个GO号，利用WEGO对AOX基因进行GO注释分析结果如图5所示，所有AOX蛋白参与植物细胞器、细胞膜、其它亚细胞结构的构成以及参与催化细胞内代谢、细胞分裂和细胞凋亡过程；一部分AOX蛋白参与信号转导、生物学调控、响应逆境胁迫等途径；只有极少数AOX蛋白参与植物生长发育和细胞分化过程。

图5 AOX基因本体论（GO）注释分析Fig.5 Gene ontology（GO）annotation analysis of AOX

2.7 非生物胁迫条件下玉米AOX基因家族的表达

在低温、高温、干旱、盐碱胁迫条件下，玉米AOX基因家族在B73根、茎和叶片部位的qRTPCR分析结果如图6所示，玉米AOX家族成员在不同的胁迫处理下呈现不同的表达特征。在低温处理条件下，Zm00001d002434在叶片中呈现下调表达趋势，但在根中呈现先下调表达，随后显著上调表达趋势，处理后24 h时表达量最高；在高温处理条件下，Zm00001d002434、Zm00001d002436在叶片中处理的5个时期均呈现上调表达，并且Zm00001d002436在叶片中表达水平较高。在干旱处理条件下，Zm00001d002434在叶片和茎中5个时期均呈现下调表达，在根部处理后12 h、24 h显著上调表达；Zm00001d017727在根部处理后12 h、24 h显著上调表达；Zm00001d002436表达水平不受干旱处理影响。在盐碱处理条件下，Zm00001d017727在处理后6 h的叶片、处理后4 h的茎和处理后4 h、12 h的根中分别显著上调表达；Zm00001d002434、Zm00001d002435在处理后12 h的根部显著上调表达。研究结果表明玉米AOX基因家族在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。

图6 4种胁迫条件下玉米AOX家族表达分析Fig.6 Expression analysis of AOX family in maize under four stress condition

3 讨论

本研究首次在8个物种的全基因组范围内鉴定了AOX基因家族，利用生物信息学分析方法，对8个物种的AOX基因家族的基因结构和功能两个方面开展了一系列研究。基因结构方面，AOX的系统进化、染色体位置、外显子-内含子结构以及保守基序组成等一系列分析结果验证了聚类分析结果的准确性。此外，还发现AOX基因具有成簇分布的特征，如玉米AOX家族中Zm00001d002434、Zm00001d002435、Zm00001d002436， 大 豆 AOX家族中KRH42153、KRH42154，高粱AOX家族中EES12781、EES12782、EES12783，马铃薯AOX家族 中 PGSC0003DMT400019707、PGSC0003DMT40-0019708、PGSC0003DMT400019709、PGSC0003DMT400019710，二穗短柄草AOX家族中KQJ84389、KQ-J84390、KQJ84391等均呈现成簇分布的特征。

基因功能方面：（1）通过启动子分析鉴定到43种顺式作用元件，其中包括器官发生、激素合成、光以及生物和非生物胁迫响应相关的顺式作用元件，表明AOX基因可能在植物生长发育以及应激反应中发挥重要作用。这与前人报道AOX作用广泛的研究结果一致［25］，本研究利用生物信息手段验证了前人研究结果的可靠性。（2）通过miRNA靶位点预测，鉴定出11个靶向作用于AOX基因的假定miRNA。其中，miR395c通过引导靶标mRNA裂解作用于玉米Zm00001d002435基因。研究表明，在拟南芥中miR395c可以延迟拟南芥种子萌发［26］。本研究中预测的miRNA为揭示AOX基因参与控制植物生长发育以及应激反应的转录后调控网络提供宝贵线索。（3）通过AOX基因GO注释分析验证了前人报道的AOX作为应激蛋白，可以保护线粒体（AOX）免受各种氧化应激条件的影响［27-31］。本研究对三叶期玉米幼苗进行了不同的胁迫处理，AOX家族成员在4种胁迫条件下呈现不同的诱导表达特征，暗示它们与逆境胁迫应答之间的密切关系。本研究发现Zm00001d002434基因在低温胁迫、Zm00001d002436基因在高温胁迫、Zm00001d002435基因在干旱胁迫、Zm00001d017727基因在盐碱胁迫响应中较为敏感，这与前人报道并不是所有的AOX基因响应所有胁迫反应结果一致［32］。因此，通过基因工程手段提高不同AOX的表达水平，有可能提高植物抵抗不同逆境胁迫的能力。

4 结论

本研究在玉米、水稻、拟南芥、二穗短柄草、番茄、马铃薯、高粱和大豆8个物种的全基因组范围内共鉴定到35个AOX基因，8个物种的AOX基因均具有成簇分布的特征。AOX基因在进化过程中保持了较高的保守性。AOX基因具有参与植物生长发育，调控多种应激响应和信号转导的潜在功能。非生物胁迫下玉米苗期根、茎、叶中AOX基因的表达情况验证了AOX基因在植物生长发育以及应激反应中的重要作用。