甜瓜CmABCG8基因的表达特性分析

洪天澍 海英 恩和巴雅尔 高峰

（1.内蒙古师范大学生命科学与技术学院，呼和浩特 010022；2.内蒙古兴安盟科尔沁右翼前旗第一中学，兴安盟 137400）

三磷酸腺苷结合盒（ATP-binding cassette）蛋白又称ABC转运蛋白，是一个广泛存在、种类繁多的超家族，它以ATP水解酶为能源，促进多种底物的跨膜转运，大多数ABC基因编码的膜结合蛋白直接参与多种分子的跨膜运输［1］，植物ABC蛋白家族由3种结构类型组成，其包括完全转运蛋白、半转运蛋白、可溶性转运蛋白。完全转运蛋白由两个跨膜结构域（transmembrane domains，TMD）和两个核苷酸结合结构域（nucleotide-binding domains，NBD）组成，半转运蛋白由一个TMD和一个NBD组成，通过形成同二聚体、异二聚体或多聚体来行使功能。第三类型的转运蛋白没有TMD，但有两个NBD，这类蛋白称为可溶蛋白类型［2］，它们都有一个胞质的核苷酸结合域（NBD）。近几年的研究发现，植物ABC蛋白不仅参与了激素、脂质、金属、次生代谢物和外源物质的运输，而且还参与了植物与病原菌的相互作用和离子通道的调节［3］。在高等植物中，ABC蛋白在系统发育上被组织成8个簇，即ABCAABCI亚家族（植物中不存在ABCH）［4］。ABCG转运蛋白是植物ABC转运蛋白家族中最大的亚家族，在拟南芥和水稻中均有40多个成员［5］，其结构为NBD-TMD，这种结构只有经过二聚才能成为功能型转运体，ABCG亚家族可分为半分子式转运蛋白和全分子式转运蛋白两类，并且功能多样化。与其他类型生物相比，ABCG亚家族在植物中的比例要大得多。其原因在于植物的固着生活方式，例如需要输出有毒化合物和植物产生的种类繁多的次生代谢物，这些次生代谢物通常需要跨膜运输到它们的作用部位［6］。研究得知，植物ABCG转运蛋白亚家族成员具有参与植物激素传递（包括生长素、细胞分裂素和独角金内酯等）功能［7］；ABCG全分子式转运蛋白参与植物体内抗重金属、抗病原菌、生长素应答、转运信号分子等功能［8-10］，而ABCG半分子式转运蛋白参与植物体内卡那霉素抗性、脂类平衡、脱落酸转运等功能［11-13］。表皮细胞的形成与角质层的合成对植物果实的生长具有重要作用［14］，有研究报道，AtABCG11参与拟南芥叶片和茎部角质形成，AtABCG13参与拟南芥花组织的角质形成［15］，水稻中OsABCG26和OsABCG15通过绒毡层细胞转运脂类。在人体中HsABCG5与HsABCG8共同作用可以促进多种底物跨细胞膜的转运［16］。

甜瓜（Cucumis melo L.）是广泛栽培的重要的经济农作物。其果实香甜，营养丰富，富含糖、淀粉、少量蛋白质、维生素、矿物质等。随着对甜瓜研究的深入，甜瓜已经成为阐明肉质果实发育成熟分子机理的植物。近年来，甜瓜转基因工程技术的广泛运用，使得甜瓜具有抗病、抗逆、耐盐碱等优良特性。目前，ABC转运蛋白家族基因的功能在甜瓜中研究较少，甜瓜中ABCG转运蛋白的研究还尚未可知。因此，对于ABCG转运蛋白在甜瓜中的功能及作用还需要进一步深入研究。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为甜瓜品种‘河套密瓜’，由本实验室 保 存。1/2 MS培 养 基、MnCl2、CuSO4、FeSO4、细胞分裂素（CTK）、油菜素内酯（BR）、过氧化氢（H2O2）等试剂购自呼和浩特洪阳生物技术有限公司，TRIzol试剂购自北京全式金生物技术有限公司，反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、荧光定量PCR试剂 SYBR®Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甜瓜CmABCG8基因的系统进化树构建 通过NCBI网站和MELONOMICS（https://www.melonomics.net/）数据库下载拟南芥、番茄、甜瓜、黄瓜4个物种的ABCG家族基因序列，通过MEGA7软件进行多序列比对，用Neighbor joining的方法做进化树分析。

1.2.2 数据库中甜瓜ABCG家族表达量分析 通过CuGenDB（http://cucurbitgenomics.org/）数据库得到甜瓜ABCG亚家族成员在根、果实、叶、雄蕊、雌蕊的表达量，使用TBtools软件做成热图，对其进行分析。

1.2.3 甜瓜CmABCG8基因的互作蛋白网络图构建 通过STRING（https://cn.string-db.org/）网站分析CmABCG8氨基酸序列，得到与其互作的蛋白数据导出后用Cytoscape软件做图。

1.2.4 甜瓜种植及处理 甜瓜种植于内蒙古自治区巴彦淖尔市磴口县，在甜瓜盛花期使用人工自交授粉，标记授粉起始日期。果实的采摘从授粉后开始，取所摘果实的中果皮组织，速冻于液氮中保存，每隔5 d采一次，直到授粉后的50 d为止；当生长期到40 d时取根、茎、叶和花4种组织，速冻于液氮中保存；选取籽粒饱满、大小均一的甜瓜种子种植于营养土中，待其长出第2片真叶后，进行不同的处理。其中，取甜瓜根部，用于金属离子处理。离 子 浓 度 分 别 为 Fe2+、Cu2+：0、50、100 和200 mg/L［17-18］，Mn2+：0、0.272、1.36 和 6.8 mg/L［19-20］；取甜瓜幼叶，用于过氧化氢（H2O2）、植物激素细胞分裂素（CTK）和油菜素内酯（BR）的 处 理，3种 处 理 浓 度 均 为 ：0、0.4、4和40 μmol/L［21］。具体方法如下，以细胞分裂素为例：配置400 mL的1/2 MS液体培养基，分装在4个三角瓶中，其中3个分别加入不同浓度的细胞分裂素（0.4、4和40 μmol/L），第4个不加，作为对照。将甜瓜幼叶或根分别用70%乙醇和0.1%的HgCl2浸泡，浸泡前后均使用无菌水冲洗、晾干。将幼叶和根分别加入对应浓度的1/2 MS液体培养基中进行室温培养，培养时间分别为2 h和36 h，无菌水冲洗、晾干，使用液氮速冻保存于-80℃超低温冰箱中。以上每种材料均设3个生物学重复。

1.2.5 RNA的提取 采用TRIzol法提取已保存材料的总RNA，将材料在液氮中冷却并迅速研磨至粉末状，每50 mg液氮研磨的嫩叶组织加入1 mL TRIzol反复吹打，室温放置5 min后，加入200 μL的氯仿强烈震荡后，室温条件下静置2-3 min，4℃ 12 000 r/min低温离心15 min，移取上清液至新的离心管中加入等量的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10 min，再低温离心10 min弃去上清液，1 mL 75%的乙醇洗涤沉淀，低温离心3 min弃上清，使用去RNase的灭菌水溶解沉淀，即得到甜瓜总RNA。经琼脂糖凝胶电泳检测和超微量紫外分光光度计检测后，将提取的RNA置于-80℃冰箱中储存。

1.2.6 cDNA的合成 以上述提取的总RNA作为模板，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒进行cDNA合成。反应体系共包括反应1和反应2两个部分。反应1主要进行RNA的变性，反应2进行cDNA的合成。反应 1体系为：取 2 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser、1 μg总 RNA，用去 RNase水补平至10 μL，混合均匀。反应程序为：42℃，2 min，4℃暂时保存。反应2体系为：1 μL Prime Script RT Enzyme Mix I、1 μL RT Primer Mix、4 μL 5×Prime Script Buffer、4 μL RNase Free dH2O 与 10 μL 反 应1混合液混合均匀。反应程序为：42℃，15 min；85℃，5 s，冰上冷却。

1.2.7 荧光定量PCR 利用Mastercycler®ep实时荧光定量RCR仪，对样品进行表达特性分析。以合成的cDNA第一条链为模板，PCR反应体系共25 μL，其中 12.5 μL SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ，5 μmol/L的上下游引物各 2 μL，cDNA 5 μL，RNaseFree dH2O 3.5 μL。反应过程为95℃预变性10 s；95℃变性5 s；60℃退火20 s；65℃延伸10 s，共40个循环结束；同时做溶解曲线分析，95℃，10 s。使用甜瓜GADPH基因作为内参。

GADPH内参引物序列为（上游引物：5'-ATCATTCCTAGCAGCACTGG-3'，下游引物：5'-TTGGCATCAAATATGCTTGACCTG-3'）；CmABCG8基因引物序列为（上游引物：5'-AAACATCGGAATGGACAAAGCC-3'，下游引物：5'-ACGAGGACGAAGTAGGCGAAAG-3'）。

2 结果

2.1 CmABCG8的系统进化树的分析

选取拟南芥、番茄、甜瓜、黄瓜中ABCG亚家族成员的氨基酸序列构建系统进化树，结果如图1所 示，CmABCG8 与 CsABCG23、CsABCG5、CsABCG10、SlABCG19在同一支中，其中CmABCG8和CsABCG23的一致性最高。

图1 CmABCG8和拟南芥、番茄、黄瓜、甜瓜中ABCG基因的系统进化树Fig.1 Phylogenetic trees of ABCG genes in CmABCG8 and Arabidopsis thaliana，tomato（Solanum lycopersicum），cucumber（Cucumis sativus L.）and melon（Cucumis melo L.）

2.2 甜瓜ABCG家族基因表达谱热图

通过TBtools软件将甜瓜ABCG亚家族在甜瓜根、茎、叶、雄蕊、雌蕊中的表达量做成热图（图2），可明显的看出甜瓜ABCG亚家族整体在雄蕊中表达量偏高，在果实中整体表达量偏低。CmABCG8在雌蕊中表达最高，在根、雄蕊、叶中表达量较高，在果实中表达量不明显。

图2 甜瓜ABCG基因家族在不同组织中的表达Fig.2 Expression of ABCG gene family in the different tissues of melon

2.3 甜瓜CmABCG8蛋白互作网络图

通过STRING网站对CmABCG8有相互作用的蛋白质进行预测，发现CmABCD1、Pattellin-4、Ferredoxin-nitrite、Thioredoxin H2、DHN1、Tc-0109、Mildew resistance6、Sulfate transporter3.5、LOC103482955、NRT1等10个 蛋 白 直 接 与CmABCG8存在相互作用关系（图3），结合Cytoscape软件清晰标注发生互作的蛋白名称。

图3 甜瓜CmABCG8的蛋白质互作网络Fig.3 Protein interaction network of CmABCG8 in melon

2.4 果实不同发育时期CmABCG8基因的表达特性分析

在果实不同发育时期，表达量如图4所示，以0 DAP的表达量设为1，CmABCG8基因在10 DAP的表达量达到峰值，增加了1.50倍，其他时期均呈现出下降的趋势，到35 DAP时表达量达到最低，是10 DAP时表达量的1/35 000，35 DAP后，表达量又开始轻微上升，但极其不明显。

图4 甜瓜果实不同发育时期CmABCG8基因的相对表达量Fig.4 Relative expressions of CmABCG8 gene in melon fruit at different development stages

2.5 甜瓜不同组织中CmABCG8基因的表达特性分析

在甜瓜不同组织中，以根的表达量设为1，茎、叶、花的表达量都呈现上升的趋势（图5），基因在叶的表达量最高，为根的26倍。方差分析结果显示，与根相比，茎、叶的表达量差异达到极显著水平，与叶相比，茎和花的表达量差异均达极显著水平。

图5 甜瓜不同组织中CmABCG8基因的相对表达量Fig.5 Relative expressions of CmABCG8 gene in the different tissues of melon

2.6 植物激素和H2O2处理后CmABCG8基因的表达特性分析

不同浓度的CTK、BR和H2O2处理，均会诱导甜瓜叶片中CmABCG8基因的表达。处理浓度为4 μmol/L时，该基因在CTK和H2O2处理组中的表达量达到最大值；处理浓度为40 μmol/L时，在BR处理中该基因表达量达最高值（图6）。

图6 植物激素和H2O2处理对CmABCG8基因表达特性的影响Fig.6 Effects of plant hormones and H2O2 treatment on the expression characteristics of CmABCG8 gene

2.7 不同金属离子处理后CmABCG8基因的表达特性分析

不同浓度的Fe2+与Cu2+处理后的甜瓜根部CmABCG8基因表达量与对照组相比均呈下降趋势，且方差分析结果（图7）显示，对照组与其它浓度的差异性极显著。不同浓度Mn2+中，当浓度达到6.8 mg/L时表达量达到最高，与对照组相比，表达量的差异性达到显著性水平（图7）。

图7 不同金属离子处理对CmABCG8基因表达特性的影响Fig.7 Effects of different metal ion treatment on the expression characteristics of CmABCG8 gene

3 讨论

近年来，ABC转运蛋白在拟南芥、番茄、水稻中均有报道，认为该蛋白能够将外源毒性物质发生螯合作用，并将其从细胞质运入液泡，减少其对植物的伤害。随着研究的不断深入，植物中ABC转运蛋白的更多功能逐渐被发现。ABCG作为ABC转运蛋白家族中最大的亚家族，深受广大研究人员的关注，该亚家族成员可以通过响应一些植物激素或植物激素前体，在植物的生长和代谢过程中发挥着重要作用［22］。本文通过生物信息学和表达特性分析，来判断甜瓜CmABCG8行使的功能。通过蛋白网络互作图，预测到甜瓜CmABCG8与10个蛋白有相互作用，其中Dehydrin蛋白可以调控植物响应低温胁迫效应［23］；Ferredoxin-nitrite蛋白参与了高等植物硝酸盐同化还原为氨的过程［24］；Patellin蛋白具有转移脂质的能力，能在生物膜运输等过程中发挥功能［25］，可在植物激素和环境变化的调控下参与细胞分裂的过程［26］，烟草中的Patellin蛋白，能参与植物对病毒的防御［27］；NRT蛋白位于细胞原生质膜上，参与NO3-从土壤中根际向植株体内的转运和植株体内NO3-在器官、组织和细胞间的再度运输［28］；Thioredoxin蛋白是过氧化物酶家族的一员，能够替代金属离子辅基所发挥的功能，清除各种过氧化物，并且植物体内的叶绿体硫氧还原蛋白，可介导环境信号到叶绿体蛋白，维持植物体细胞氧化还原稳定性，提高植物本身的抗逆性［29-31］。因此猜测CmABCG8在甜瓜中可能具有类似这些蛋白的功能。

基因表达差异能够揭示基因行使的功能，使用实时荧光定量的技术能够分析出基因的作用和功能。通过不同金属离子对甜瓜根部处理后，发现CmABCG8的表达量呈下降的趋势，但随着金属离子浓度的增加，表达量有回升的趋势，在Mn2+的浓度达到6.8 mg/L时表达量有明显的上升，推测CmABCG8对不同的金属离子存在剂量效应。通过果实不同时期的表达量，得出CmABCG8基因在果实发育前期表达量很高，而在果实发育后期不明显，该结果与甜瓜转录组得到的数据完全一致，可说明CmABCG8基因在果实发育前期发挥一些作用。通过外源H2O2和植物激素CTK、BR对甜瓜幼苗处理，表达特性结果显示，3种处理均能大幅度影响CmABCG8基因的表达量，与对照相比，随着浓度增加，均呈现出上升的趋势，但达到一定浓度后，表达量有下降的趋势，但还是远远高于对照组表达量。推测CmABCG8对不同植物激素的影响存在剂量效应，除可以调节果实发育外，还能抵抗环境压力［32］，由本试验结果能看出外源植物激素能够诱导CmABCG8基因的表达，是否可以通过调节外源植物激素来加强甜瓜面对多种复杂的环境胁迫，还要继续进行深入研究。

4 结论

甜瓜ABC转运蛋白亚家族G成员CmABCG8基因在叶中表达量显著高于其他组织，果实发育早期表达水平较高，H2O2、CTK、BR等处理均能诱导CmABCG8的表达，推测其可能在果实膨大期发挥重要作用，并且CmABCG8可能在甜瓜金属离子转运和抵抗非生物胁迫的过程中发挥作用。