林业外来入侵生物溯源技术研究进展与展望

石娟覃责实赵佳强

(1.北京林业大学林木有害生物防治北京市重点实验室，北京 100083；2.北京林业大学中法欧亚森林入侵生物联合实验室，北京 100083)

在世界自然保护联盟公布的全球100种最具威胁的外来物种中，入侵我国的就有50余种。当前我国已确认的入侵物种有660余种，其中大面积危害且严重的达100多种；《中国经济周刊》2020年8月4日报道称，每年造成直接经济损失逾2 000亿元。松材线虫Bursaphelenchus xylophilus、美国白蛾Hyphantria cunea等重大外来林业有害生物持续扩散且危害严重；此外，新发、突发外来物种入侵形势也非常严峻。21世纪初以来，每年新发、突发5～6种，累计传入我国的农林入侵物种达103种，是20世纪80年代的10倍以上。潜在入侵物种基数大，“十三五”期间，口岸截获有害物种累计8 000余种360万批次，分别是20年前的9.8倍和51.5倍。重大外来入侵物种肆意扩散蔓延，新发、突发入侵物种频频犯关，已严重威胁到我国林业安全、生态安全、林产品贸易安全和人畜健康[1-2]。

在全球气候变暖的背景下，预计会有更多的地区将随着温度的升高而变得更加适合林业入侵有害生物的生存繁殖，特别是昆虫，因具有高繁殖率、极强的生理耐受性和极易传播扩散飞行等特性，使其对林业具有更大的危害性[3]。因此林业入侵有害生物溯源追踪对我国的林业生产安全和生态环境建设具有重要意义。

笔者使用软件VOS viewer对林业外来有害生物溯源领域内近10年发表的文章进行聚类分析，基于大数据的文献检索结果将关键词聚为一个大的群簇。其中，群簇的中心词“geographical origin(地理来源)”与“classification(分类)”以及“trace(溯源)”紧密地聚集在一起，常用于溯源的分析元素如“stable isotope(稳定同位素)”、“microbial communities(微生物群落)”、“chemical composition(化学组成)”等也聚集在中心词附近(图1)。

图1 基于VOS viewer对溯源技术近10年文章的聚类分析Fig.1 Cluster analysis of articles in traceability field in recent 10 years based on VOS viewer

溯源往往和安全问题紧密联系在一起，溯源在生物安全领域的意义可以从“目的”和“功能”的角度分别阐述。从目的角度来看，溯源可以识别扩散源头从而阻断其传播途径；从功能角度来看，溯源可以对有害生物的传播和扩散历史进行复盘，还可以为生物防治提供线索和途径。对于外来种的溯源，国外研究机构多利用多组学等遗传学分析方法，研究入侵物种的分子溯源追踪技术，评估入侵物种在气候变化下的生态适应性和跨境传播扩散规律，以便有效预测其未来发生和流行风险，进而实现入侵物种的早期发现、实时监测、精准溯源或狙击拦截。入侵生物溯源流程图见图2。

图2 入侵生物溯源流程Fig.2 Flow of invasive organism traceability

生物在环境中的扩散和传播是一个复杂的过程。以昆虫为例，既有探索性的无序运动(扩散)与固有的长期定向运动(迁移)[4]，同时由于人为因素的介导，使得这个过程更加复杂。除此之外，入侵生物的体型可能很小，例如病原微生物、植物的根茎或种子、以及大部分昆虫等。这些因素构成了外来入侵生物溯源中所面临的几个难题:1)外来物种无法进行人工标记，只能依靠自然标记元素进行溯源分析；2)对于新发入侵物种，其分布范围和数量可能非常有限，导致用于实验检测或分析的样品量可能很小；3)入侵物种所处的野外生境复杂，对于实验检测和判别分析存在较多干扰。

1 外来入侵生物溯源追踪技术研究进展

目前，国内外已经开发出了物理、化学以及生物学等多种标记手段，用于外来物种的溯源。理想的溯源技术是与有害生物的生物学习性相一致的，具有低成本、高时效并且易于操作的特点。

1.1 文献溯源

文献溯源是基于已发表的论文和各省市县林业及森防部门的报道资料，以及机场口岸、港口口岸的检疫截获报告等文字材料，然后按照时间和地点整理入侵生物的暴发时间节点，从而总结出入侵物种的大致扩散趋势，重塑入侵路线。

万宣伍通过文献检索发现桔小实蝇Bactrocera dorsalis于1912年首次在我国台湾报道发现，而后于1934年在海南发现其危害，1950—1970年，在我国的广东、广西、云南等地相继暴发，而后在华南、西南各地大范围的扩散；自21世纪初以来，桔小实蝇呈现出向北推移的趋势，在湖北、重庆、浙江等地被报道；基于文献记录，桔小实蝇在我国的扩散源头为台湾，表现出从沿海到内陆、从南到北的扩散趋势[5]。

王瑞基于文献报道和标本记录将紫茎泽兰Ageratina adenophora在我国的扩散路径进行重塑。20世纪40年代在云南省首次发现紫茎泽兰，1960—1969年其从云南南部向东北部扩散，70年代中期紫茎泽兰已经扩散到了贵州省的西部南部和广西西部，70年代末期紫茎泽兰向北扩散至四川省南部的盐源县，2003年重庆市和湖北省秭归县也发现其危害[6]。

已发表的文献和官方的报告是相对真实可靠的资料，相较于其他溯源方法更具有说服力，呈现方式也更加直观。但是文献记录的资料往往并不全面，因此在实际应用中，常将文献溯源与其他溯源方法联合进行分析。

1.2 轨迹分析溯源

当物体在空气中移动的时候，会形成特定的轨迹，而研究这种轨迹的方法就是轨迹分析。轨迹分析法最开始应用于气象分析领域，主要分析气团在大气中的移动路径。而后，其研究对象逐步扩展至花粉、真菌孢子、昆虫等。借助二维乃至三维的轨迹分析模型，如拉格朗日混合单粒子轨道模型(HYSPLIT，hybrid single particle Lagrangian integrated trajectory model)，以及不同的气象分析模型如MM5模式和WRF模式等，实现迁移扩散路径重构，从而对研究对象的来源地进行判别[7-8]。

轨迹分析溯源技术，需要大量的前期工作铺垫。以昆虫为例，需要完备的虫情数据和准确的气象数据，这一部分数据直接影响结果的准确性。其中虫情数据包括田间或林间捕获量、幼虫的发生面积和密度、越冬基数、生活史的跟踪调查数据(主要源于病虫测报站和植保、森保站的历年监测资料)，及昆虫的飞行能力(飞行速度、飞行高度、飞行耐力等)；气象数据主要包括风向、风速和温度三要素(源于气象站的观测资料)。

周立阳等基于江淮稻区总共750个研究日的数据，长达10 a的观测资料，分时间段对7个研究地点的稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis给出了精确的虫源地和概率贡献，以及具体的迁飞路径[9]；邓晓悦等对川西高原草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda虫源地的轨迹分析结果表明，迁入川西高原草地贪夜蛾的虫源地主要为云南西北部、西藏东南部和缅甸北部[10]。

刘伟等使用轨迹分析技术对小麦白粉病菌Blumeria graminisf.sp.tritici(Bgt)孢子的田间传播距离与传播量的初步定量分析发现，白粉病菌分生孢子在病害发生初期虽然传播量较低，但在菌源中心北向和东向40 m处均可以捕捉到病菌孢子，当菌源中心病情指数达到16.67时，距菌源中心北向20 m和东向40 m处分生孢子的捕捉量迅速增加，这表明分生孢子的田间传播量与菌源中心病情密切相关[11]。

1.3 花粉标记溯源

花粉标记溯源的方法是通过鉴定研究对象所携带的花粉，然后基于花粉所属植物的分布区数据，从而获悉其来源地或过境区域[12-13]。花粉是一种非常理想的标记元素，原因有以下3点:1)依赖媒介生物传粉的植物已经进化出能自然附着在传粉生物体表的花粉；2)花粉外壁能够抗高压、高温、腐蚀，对物理、化学和酶的降解都比较稳定；3)花粉的形态特征包括大小、表面的纹路、萌发孔数目以及对称性等众多因素，基于形态学特征可将花粉鉴定至科、属，有的甚至可以鉴定到种。

受到生长发育条件的限制，自然界中的大多数植物有其独特的分布区域，在研究中通常将附着生物表面的花粉作为溯源追踪的间接证据[14]。但是，该方法只适用于大尺度的分析，即花粉来源地必须在远离携粉生物被捕获的地区。Hendrix等在美国阿肯色州采集了一批被信息素诱捕器诱捕的玉米夜蛾Heliothis zea，而这些玉米夜蛾68%的个体都携带有朱缨花属Calliandraspp.或猴耳环属Pithecellobiumspp.植物的花粉，这些植物离诱捕地点最近的地方是得克萨斯州，这表明这些夜蛾至少迁徙了1 207 km[14]。

尽管将花粉作为自然标记具有一定的优势，但这种方法在外来物种溯源的研究中受到的关注有限，有几个因素限制其广泛应用。1)研究对象只能是有访花习性的生物；2)花粉分析成本高、耗时长、过程繁琐，需要花粉分类学方面的专业知识[15]；3)花粉作为一种生物标记物的实用性可能会受到开展研究的时间影响[13-14]。

1.4 分子标记溯源

由于地理隔离或其他环境因子的差异，入侵生物会发生遗传变异，而这些遗传变异则成为一种独特的自然标记。分子标记溯源是一种基于分子标记技术分析不同地理种群之间的遗传信息的差异，从而获得外来物种扩散、传播、起源和种群关系等相关信息的技术[16]。其中，代表性技术有DNA条形码技术、限制性片段长度多态性技术(RFLP，restriction fragment length polymorphism)、随机扩增多态性DNA(RAPD，random amplified polymorphism DNA)、微卫星标记(SSR，simple sequence repeats)、环介导恒温核酸扩增技术(LAMP，loop-mediated isothermal amplification)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA，recombinase polymerase amplification)等。 此外，随着第三代测序技术例如纳米孔外切酶测序(nanopore)、实时单分子 DNA测序(SMRT，single molecule real-time)等的出现，大幅提高了检测的精准度和时效性。

进行分子溯源的关键是选取合适的遗传标记，既需要相对高的多态性以阐明不同地理种群的差异性，同时还需要足够的稳定性。左伊凡等基于舞毒蛾Lymantria disparLinnaeus 9个核基因的微卫星位点对全球23个地区舞毒蛾的遗传结构和多样性进行分析发现，欧洲型舞毒蛾可能已经入侵到中国；同时推测少量的舞毒蛾日本亚种已经被传入到俄罗斯远东地区[17]。汪青桐等基于松材线虫的SNP位点对我国华东地区6个省共67份松材线虫样品的分析结果表明，大部分华东地区的松材线虫种群间具有相同的传播来源，并且以苏皖为中心向外扩散[18]。

由于分子标记溯源技术不受研究对象种类的限制，分析所需要的生物量很小，且用于对比分析的基因数据库建设完备，是目前溯源研究中使用最广泛的方法。但是，分子标记技术仍然受到一些因素的制约。1)分子溯源的结果依赖于采样的覆盖度，若分析使用的种群不完整，将导致溯源结果出现偏差；2)随着标记基因的选取不同，结果往往也存在一定的差异，曾经出现过线粒体基因和核基因分子分析结果不一致的情况[19]。

1.5 稳定同位素溯源

稳定同位素技术是涉及多个科学领域(包括生态学、地球科学等)，分析方法涉及统计方法(包括聚类分析、判别函数分析等)的新型溯源技术。生物体的同位素组成与元素利用率、自身的代谢方式以及生命活动周期等因素息息相关。生物体组织中的稳定同位素组成反映了当地食物网的特征。反之，食物网的同位素特征可以传递给在这些食物网中取食的消费者[20-21]。在不同食物网之间移动的生物可保留先前取食位置的同位素信息，而同位素信息被保留的时间取决于相关联组织的元素周转率[22]。一些角质组织如鸟类的羽毛、昆虫的外骨骼在合成后是代谢惰性的物质，可以较长时间地保留它们被合成时位置的同位素信息[23]。Hobson等利用碳、氢稳定同位素技术追踪了北美洲黑脉金斑蝶Danaus plexippus的迁徙规律[24]；Hungate等利用氢稳定同位素技术追溯到在美国俄勒冈州的波特兰国际机场截获的日本丽金龟Popillia japonica来源于美国本土的东南部[25]。

使用稳定同位素技术溯源需要注意:1)同位素分析需要相对大量的样本量，对于体型较小的生物进行质谱法分析时，必须将单独的个体汇集起来，否则无法实现对单个生物体的分析；2)稳定同位素的指示结果依赖于所选择的同位素的地理分布模式，仍有许多同位素的地理规律并不明确；3)F1代幼虫取食当地的植物，F1代成虫的稳定同位素特征就与当地环境的同位素特征相匹配，但是当F2代的幼虫取食新地点的植物，那么F2代成虫的同位素特征就会反映新的环境特征。通过对成虫同位素的测定，即可分析出幼虫的来源地，以判别其是否在当地定殖。基于该特性，稳定同位素技术适用于短期内新发疫区的虫源地分析。

1.6 肠道微生物溯源

与昆虫相关的微生物菌落(例如细菌)在宿主的生存、发育和繁殖过程中起着至关重要的作用[26-27]。在许多昆虫肠道内都分离出具有高度多样性的细菌种类[28-30]，而这种高度多样性是环境因素作用的结果[31-32]。有学者认为，特定生物的微生物群落特定于某个地理区域[33]。因此，与昆虫相关的微生物群落(例如细菌)可能会反映其扩散或地理来源。

由于微生物群落的复杂性，与昆虫有关的微生物生态系统非常复杂[31]。同时，这些肠道微生物难以进行体外培养进而阻碍了对其多样性和种群结构等方面的研究。随着PCR-DGGE以及宏基因组等技术的出现与发展，有效地解决了这一问题。许多研究也证明了昆虫肠道微生物与宿主的地理分布密切相关，如2021年，Yu等对中国云南楚雄腮扁叶蜂Cephalcia chuxiongica4个地理种群的肠道微生物进行研究，发现肠道菌群的系统发育和多样性与宿主的地理、遗传距离有关，即随着地理、遗传距离的减小，菌群的相似性增加；反之，菌群的相似性减少[34]。

2 外来入侵生物溯源技术存在的不足

Aly Farag Ei Sheikha曾在文章中指出“广义上科学的溯源技术并不存在，我们只能通过间接的分析手段来无限趋近真相[35]。”而溯源分析的内核就是可用于差异性判别分析的数据库，目前只在分子溯源领域建有相对完备的数据库，其他溯源方法并没有统一的数据库。此外，如稳定同位素溯源技术，没有一个统一的标准或系统对不同地理种群进行划分，导致同类研究之间关联性低。对于大多数现有的溯源技术而言，一开始并不是专门为了林业外来物种而设计的，导致林业入侵生物溯源的相关研究比较匮乏。

从原理上来讲，林业入侵生物溯源技术是一种间接的分析手段，依赖于数据的拟合以及数学模型的预测。虽然每种溯源技术都有自己的优势和特点，但在实际应用中存在不足，现将每种溯源技术的不足之处列入表1。

表1 现有溯源技术的不足Tab.1 Shortages of existing traceability technology

3 溯源追踪技术在林业外来入侵生物防控领域的应用前景和建议

随着我国改革开放的不断深入，自由贸易港和“一带一路”等对外开放建设的实施，国外危险性有害生物随着贸易物流传入我国的风险越来越高，外来入侵生物的精准溯源成为解决国际贸易争端中最重要的科学证据。因此，不断强化外来入侵生物溯源追踪能力势在必行，以便应对各种挑战。

3.1 建立不同种类、不同地域来源入侵生物的有效溯源指标体系

在溯源中最重要的环节是建立可以识别不同地理类群的数据库，例如分子溯源的GenBank、European Molecular Biology Laboratory和DNA Data Bank of Japan等，为基因数据分析比对提供了强大的支撑。其他的溯源技术例如轨迹分析溯源、稳定同位素溯源虽然有比较多的研究群体，但是各研究人员所得到的数据并没有在一个数据库收录汇总，同时缺乏统一的判别标准对不同的地理种群数据进行划分，导致众多国内林业入侵生物溯源追踪的结果之间没有可比性，只能作为单独的研究成果。限于资料共享的局限性，导致了目前我国林业入侵生物溯源对象种类、数量较少，方法、模型运用单一的状况。在信息共享化和开放化的时代背景下，应充分利用这种便利条件建立我国的林业外来入侵物种数据库，收录、整理入侵生物研究领域内的溯源结果，同时保留样品分析的关键信息，例如采集年份、采集地点的经纬度及海拔等关键性基础信息。这将使我国溯源领域更加规范和统一，对于地理溯源以及扩散路径重构具有重要意义。

3.2 更新溯源模型或数据库

以稳定同位素溯源为例，其溯源分析的前期需要明确所研究的同位素元素在自然环境中的分布模式，且该元素在地理分布上具有可供判别分析的显著性差异，以作为不同地理区域样品差异性分析比对的标准。因此，这些同位素数据库的覆盖度和精准性直接影响着溯源的结果。目前绝大多数同位素的地理分布模式尚未形成数据库，已有的同位素数据库例如由国际原子能与世界气象组织联合构建的全球降水氢稳定同位素数据库(https://wateriso.utah.edu/waterisotopes/index.html)(OIPC 3.1)，其收集的原始数据主要时间段为1960—2000年，虽然该网站一直在优化数据库算法，但是其原始积累数据面临长期未更新的问题[36]。以分子溯源和轨迹分析溯源为例，这一类溯源技术对于数据的处理依赖于数学分析或各种判别模型，但是部分研究人员只是了解软件所需输入的文件类型及参数设置情况，对于模型的原理、运行过程研究较少。对于这一领域的创新或突破是一项专业性强且工作量大的工作，需要多学科人才组成团队来共同努力。这一领域的进步将利于相关领域的研究人员挖掘、对比、分析同类溯源数据，使得溯源技术的精度和应用前景上升到一个新的高度。

3.3 拓展溯源手段和研究对象的应用场景

目前溯源领域发表的文章主要是与农业昆虫相关的分子溯源，而针对林木病虫害和杂草的溯源技术手段较为匮乏。据杨静洁等的研究，稳定同位素在植源性农产品的溯源领域中展现出了非常理想的效果[37]，这也意味着稳定同位素技术在林业有害杂草的溯源中具有很好的应用前景。据此，可以多方面学习其他领域的相关技术，使技术突破学科的限制，从而弥补技术手段欠缺的现状。其次，大多数溯源技术都只研究了物种的单一状态，以昆虫为例，大多研究成果都聚焦于成虫，但在实际检疫过程中，海关或口岸截获的样品可能还包括其他虫态，如卵、幼虫(不同龄期)和蛹。因此，现有的溯源成果能否直接应用于其他的虫态，以及不同的溯源标记在各个虫态间是否存在一个转换比率等问题还需要进一步探索，这对于溯源的实际应用具有重要意义。其次，对于林业有害生物而言，研究对象从真菌，线虫，乔木、草本植物，食叶类害虫至蛀干类害虫等等，其种类多样、复杂，生物学习性跨度大，而且研究人员溯源目的和应用场景也各不相同，因此在实际应用过程中应该综合分析各个因素，选取合适的溯源技术手段或耦合多种溯源技术，从而达到理想的追踪溯源效果。

3.4 加强国际交流合作

从国际溯源技术的发展和我国生物安全的需求来看，积极参与国际植物检疫合作，吸收其他国家的先进经验，以逐步建立、完善我国外来入侵生物溯源数据库，将使我国溯源技术发展事半功倍，合作的重点主要为以下四个方面:一是加强与美国、法国、加拿大等发达国家进行数据库、溯源技术、分析模型等方面的交流；二是进一步加强与周边邻国(如印度、巴基斯坦、俄罗斯、东盟各国等)在外来有害生物跨境传播以及口岸贸易风险分析等方面的合作，与贸易伙伴积极探索构建双边或多边的疫情信息共享机制；三是与国际研究机构就林业有害生物的基础信息或气象、环境数据资料进行合作；四是加强与国际植物保护组织的合作，积极参与国际标准的起草。

4 总结

溯源追踪是林业有害生物链式防控中的重要一环，明确外来物种的来源地和传播途径将有助于相关部门制定更为精准的防控策略和检疫措施。林业外来入侵生物溯源领域需呈百花齐放的态势，充分利用各个溯源技术的优势以满足国家检疫检查等工作的需要。