“cell-in-cell”对胃癌细胞生物学行为的影响*

孙静 闵婕 单宇鹏 雷鸽 张峰

(空军军医大学第二附属医院肿瘤内科，陕西 西安 710000)

统计显示，每年新发胃癌和死于胃癌的患者分别约为100万例和80万例，占所有恶性肿瘤的5.7%和8.2%，发病率和死亡率均分别排名第六和第二[1]。但目前，胃癌发生和发展的机制则仍不清楚。在肿瘤细胞培养过程中，会发现一些带有内部空泡和多个细胞核的大细胞，即一个细胞在另一个细胞内的情况，被称为“cell-in-cell”结构[2-3]。免疫细胞与肿瘤细胞的“cell-in-cell”结构会提高肿瘤的恶性程度[4-5]，一项临床研究显示“cell-in-cell”结构与口腔舌癌的侵袭性特征和癌症相关死亡率有关[6]。然而，关于“cell-in-cell”结构对胃癌的影响则仍不清楚，至今也鲜有研究报道。为此，本文就胃癌肿瘤细胞与免疫细胞“cell-in-cell”对肿瘤细胞生物学行为的影响进行研究，以期为胃癌的诊断和治疗提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞BGC823(ATCC，美国)；96孔、24孔组织培养板(康宁公司，美国)；RPMI 1640培养基(Gibco公司，美国)；BALB/c小鼠[SPF级，雄性，6～8周龄(20±2) g，浙江医院实验动物中心， SYXK(浙)2021-0017)]；免疫磁珠(Invitrogen公司，美国)；吉姆萨试剂(碧云天公司，中国)；凋亡试剂盒(Annexin V-FITC和PI)(耶森公司，中国)；流式细胞仪(Becton公司，美国)；基质胶和Transwell装置(Corning公司，美国)。本次动物实验符合3R原则，并且实验方案经过空军军医大学第二附属医院动物伦理委员会的批准。

1.2 小鼠免疫细胞的分离 小鼠颈脱臼处死，在无菌的环境下收集得到脾脏中细胞悬液，通过密度梯度离心法分离单核淋巴细胞(PBMC)，使用免疫磁珠传话PBMC。PBMC培养在RPMI 1640培养基中，培养基含有10%的胎牛血清，将细胞在5%CO2培养箱中于37°C和95%湿度下培养。

1.3 胃癌细胞培养和“cell-in-cell”模型的建立 人胃癌细胞BGC823培养在DMEM完全基中，培养基含有10%的胎牛血清、0.1 mg / mL的链霉素和100 U/mL的青霉素。将细胞在5%CO2培养箱中于37°C和95%湿度下培养。根据参考文献[7]构建肿瘤细胞与免疫细胞的“cell-in-cell”模型。按照靶效比1∶1和5∶1加入已标记的胃癌细胞分别为1∶1组和5∶1组，分别接种到24 孔板中，每孔细胞总数为5×104个。在上述条件下孵育6 h。然后BGC823细胞单独培养作为对照。

1.4 检测方法

1.4.1 “cell-in-cell”构建率 培养后细胞加入2.5%的戊二醛在4℃固定20 min，然后加入10%的吉姆萨试剂1在室温下染色1 min；洗涤后加入10%的吉姆萨试剂2室温下染色10 min。显微镜下观察，随机选择5个高倍视野，“cell-in-cell”构建率=(“cell-in-cell”细胞数/总细胞数)×100%。

1.4.2 CCK-8检测细胞增殖活力 将100 μL的细胞悬浮液添加到96孔板的孔中，孵育24 h、48 h和72 h后，将体积为10 μL的CCK-8溶液添加到每个孔中并孵育2 h。在450 nm波长下，用酶标仪检测每个孔的光密度(OD)值。

1.4.3 流式细胞术检测细胞凋亡 将细胞用1×PBS洗涤并悬浮在100 μL结合缓冲液中。加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI(中国上海耶森)，在室温下于黑暗中孵育10～15 min。最后，将400 μL的结合缓冲液添加到样品中，并在1 h内通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4.4 Transwell检测侵袭 将基质胶(1∶8稀释)加入Transwell装置的上室并在 37℃下孵育 30 min。将 600 μL完全培养基填充到 24 孔板-Transwell 装置的下室。将细胞在无血清培养基中于37℃培养 24 h进行饥饿处理。消化后，向水合的 Transwell 上室中加入 100 μL 细胞溶液(5×105个细胞/mL)。24 h后，洗去未侵入的细胞。渗入下室的细胞用95%乙醇固定，0.1%结晶紫室温染色20 min。在×400倍视野中的5个随机视野中计数细胞数。

2 结果

2.1 胃癌细胞与免疫细胞“cell-in-cell”形成情况 深紫红色为细胞核，浅紫色为细胞质，黄色箭头为形成的“cell-in-cell”结构，见图1。1∶1组的“cell-in-cell”构建率为(8.65±1.06)%，5：1组的“cell-in-cell”构建率为(12.92±1.32)%，显著高于1∶1组(P<0.05)。

图1 胃癌细胞与免疫细胞“cell-in-cell”形成情况(400×)Figure 1 Gastric cancer cell and immune cell "cell-in-cell" formation

2.2 “cell-in-cell”形成对胃癌细胞增殖能力的影响 3组细胞的增殖能力比较差异显著(P<0.05)。1∶1组的增殖能力显著高于对照组(P<0.05)，5∶1组的增殖能力显著高于1∶1组和对照组(P<0.05)。见表1。

表1 “cell-in-cell”形成对胃癌细胞增殖能力的影响Table 1 The effect of "cell-in-cell" formation on the proliferation of gastric cancer cells

2.3 “cell-in-cell”形成对胃癌细胞凋亡的影响 3组细胞的凋亡率比较差异显著(P<0.05)。1∶1组的凋亡率(4.06±0.45)%显著低于对照组(6.27±0.58)%(P<0.05)，5∶1组的凋亡率(2.95±0.34)%显著低于1∶1组和对照组(P<0.05)。见图2。

图2 流式细胞术检测“cell-in-cell”形成对胃癌细胞凋亡的影响Figure 2 Flow cytometry detects the influence of "cell-in-cell" formation on the apoptosis of gastric cancer cells

2.4 “cell-in-cell”形成对胃癌细胞侵袭的影响 3组细胞的侵袭能力比较差异显著(P<0.05)。1：1组的侵袭能力显著高于对照组(P<0.05)，5∶1组的侵袭能力显著高于1∶1组和对照组(P<0.05)。图3、表2。

图3 Transwell检测“cell-in-cell”形成对胃癌细胞侵袭的影响Figure 3 Transwell detects the influence of "cell-in-cell" formation on gastric cancer cell invasion

表2 “cell-in-cell”形成对胃癌细胞侵袭的影响(个，Table 2 The influence of "cell-in-cell" formation on the invasion of gastric cancer cells

3 讨论

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，大部分患者在确诊时已处于中晚期，这使得死亡率大幅升高[8-10]。胃癌的复发和转移是导致治疗失败的主要原因[11-13]，寻找胃癌细胞增殖和侵袭的机制具有重要的临床意义。

研究显示免疫抑制在肿瘤的发生和进展中起着重要的作用，一方面，肿瘤细胞表面会产生包括PD-L1等免疫抑制的蛋白，并直接与免疫细胞表面的受体结合导致免疫细胞的功能抑制或者凋亡[14-17]；另一方面，肿瘤细胞也会分泌免疫抑制因子，从而来降低机体的识别和清除肿瘤细胞的能力[18-20]。免疫细胞与肿瘤细胞的“cell-in-cell”结构是近年来发现的一种新的细胞现象，即一个活细胞侵入另一个活细胞[21-22]。近年来研究显示，免疫细胞与肿瘤细胞也可形成“cell-in-cell”结构，并且与肿瘤免疫相关，如Wang等[23]的研究显示结肠癌细胞可以内化淋巴细胞，并且这种免疫细胞与结肠癌细胞形成的“cell-in-cell”结构有助于逃避宿主免疫防御。也有研究显示在乳腺癌组织中发现了“cell-in-cell”结构，并且临床研究结果显示“cell-in-cell”结构的增多与乳腺癌患者不良预后有关[24]。为分析胃癌细胞与免疫细胞是否可以形成“cell-in-cell”结构，本研究从小鼠脾脏中收集了PBMC，并分别按照PBMC：胃癌细胞比例为1∶1和5∶1的比例混合接种，通过显微镜观察，可清晰的观察到细胞的内化结果，其中5∶1组的“cell-in-cell”构建率显著高于1∶1组。本次研究成功的构建了胃癌细胞与免疫细胞的“cell-in-cell”模型。

为在细胞水平上分析“cell-in-cell”对胃癌细胞生物学行为的影响，本研究分别检测了各组细胞的增殖、凋亡和侵袭情况。结果显示“cell-in-cell”的形成能够显著的促进胃癌细胞的增殖和侵袭能力，并且抑制凋亡。此外，随着“cell-in-cell”比例的升高，细胞的增殖和侵袭能力被进一步促进，且凋亡率也被进一步抑制。研究显示“cell-in-cell”的形成能够促进头颈部鳞状细胞癌细胞的增殖并抑制凋亡[25]。Miyatake等[26]的研究也显示“cell-in-cell”的形成会促进胰腺导管腺癌细胞的侵袭能力。结合过往文献报道和本次研究结果，提示免疫细胞与胃癌细胞形成的“cell-in-cell”会促进胃癌细胞的恶性生物学行为，促进胃癌细胞的增殖和侵袭，并抑制凋亡。

然而，本研究也存在不足之处，首先，关于“cell-in-cell”结构对胃癌细胞的生物学行为的而影响和对机体免疫的影响仍需要体内研究证实。“cell-in-cell”结构在胃癌组织中的形成情况、与临床病理数据的关系和与患者预后的关系则仍需要进一步的临床研究。此外，“cell-in-cell”形成的分子机制和调控胃癌细胞生物学行为的分子机制也值得深入研究。

4 结论

胃癌细胞与免疫细胞形成的“cell-in-cell”结构不但会提高胃癌细胞的增殖和侵袭能力，还会显著抑制细胞凋亡。此外，PBMC的比例升高会提高“cell-in-cell”的形成率，并更显著地促进胃癌细胞的增殖和侵袭。本研究揭示了一种胃癌进展的新机制，提示cell-in-cell”可能成为诊断和治疗胃癌的新方向。