大鼠原代神经元中依达拉奉对糖氧剥夺损伤的保护及对ROS/TXNIP/NLRP3通路的影响*

吴键 柳华 张云茜 罗丽华 杨志秀 尚正良 刘姚 隆昱洲

(1.云南大学附属医院·云南省第二人民医院·云南省眼科医院神经外科，云南 昆明 650021；2.成都市第三人民医院神经内科，四川 成都 610014；3.云南大学附属医院·云南省第二人民医院·云南省眼科医院神经内科，云南 昆明 650021)

脑卒中是一种常见的具有高致残率和高死亡率的疾病，其中主要为缺血性脑卒中(Ischemic stroke,IS)，其发生率和死亡率分别为0.247%和0.115%[1]。在我国，IS发生后1年内，病死率高达11.4%～15.4%[2]。目前，治疗缺血性脑卒中安全有效的方法是3 h内使用重组人组织型纤溶酶原激活物(Recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA)进行溶栓治疗[3]。然而，受限于极窄的溶栓时间窗，在我国仅有2.4%的患者进行了有效的溶栓治疗，远低于美国的25.1%[4]。脑缺血损伤后，产生大量的氧化自由基，进一步导致神经元凋亡、脑水肿、脑梗死。研究表明，依达拉奉作为一种氧化自由基清除剂，在缺血性脑卒中能够抑制氧化自由基导致的损伤，发挥神经元保护作用[3-4]。此外，在创伤性脑外伤模型中发现，依达拉奉能够降低氧化自由基水平并减少损伤体积[5]。硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP)是细胞内源性氧化应激和炎症调节因子，在缺血性疾病中发挥重要作用。研究表明，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)通过ROS敏感的TXNIP激活NLRP3(NLR Family Pyrin Domain Containing 3)炎症小体[6-7]。NLRP3/ASC/caspase-1信号通路激活后，细胞合成并释放IL-1β， IL-18导致神经元和胶质细胞凋亡和焦亡[8-9]。因此，本研究认为依达拉奉可通过ROS/TXNIP/NLRP3信号通路降低缺血性脑卒中神经元的损伤。本研究通过体外培养的SD大鼠皮质神经元来研究依达拉奉对缺氧神经元的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康出生24 h内新生SD大鼠16只，购自昆明医科大学实验动物中心。所有动物护理和实验均按照中华人民共和国实验动物护理和使用科学技术委员会进行，所有动物实验经云南大学附属医院伦理委员会批准通过(2019043)。主要试剂: 依达拉奉、PBS购自sigma；Cell Counting Kit-8(CCK-8)、流式凋亡检测试剂盒购自同仁化学研究所；NeuN抗体购自 Abcam公司，NLRP3(Bioss,1∶1000)、ASC(Bioss,1∶1000)、TXNIP(Abcam,1∶1000)、caspase-1(Bioss,1∶1000)、IL-18(Bioss,1∶1000)、IL-1β(Bioss,1∶1000)一抗抗体购自KPL公司。电泳仪及电泳槽(E-C Apparatus Corporation，美国)；全波长酶标仪、Western blot 转膜仪、Cytation5 荧光成像系统和 Gel Doc 凝胶成像仪(Bio-Rad，美国)；流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠离体皮质神经元的培养 新生SD大鼠用75%酒精浸泡消毒皮肤后，迅速断头取脑。剥离出整个脑组织放入有10 mL解剖液(DMEM/F12基础培养基+1%双抗)的培养皿中，体式显微镜下找到脑膜，剥离脑膜，用显微剪轻轻剪下大脑皮层组织，放入盛有解剖液的培养皿内，转移至超净工作台内。用显微剪将取下来的大脑皮层组织在解剖液内剪成约1 mm3大小，用巴氏吸管将组织块连同解剖液转移至15 mL离心管内，1000 rpm离心3 min，弃上清，0.25%胰酶消化10 min，巴氏吸管轻轻吹打成单细胞悬液，计数后种植于细胞培养板中。每两天换液一次。

1.2.2 培养神经元的鉴定 分离培养原代神经元接种至放有包被细胞爬片的24孔板中培养，5天后取出细胞，2%多聚甲醛固定细胞30 min，0.01 M PBS漂洗3次。加入5%羊血清室温封闭60 min，加入按1∶200稀释的NeuN一抗，4℃冰箱过夜。第二天取出细胞复温至室温，加0.01 M PBST漂洗4次，加荧光二抗于样本上进行标记，37℃避光孵育1h后以0.01 M PBST漂洗3次。最后滴加50 μL的抗淬灭封片剂(含DAPI)封片，荧光显微镜下观察，拍照。

1.2.3 糖氧剥夺细胞模型的构建 分离培养大鼠皮质神经元并将培养的大鼠神经元随机分为4组，分别是：①大脑皮层神经元正常培养。②大脑皮层神经元+糖氧剥夺2 h+复糖氧12 h。③大脑皮层神经元+500 μM依达拉奉。④大脑皮层神经元+500 μM依达拉奉+糖氧剥夺2 h+复糖氧12 h。其中缺氧条件为3%O2、5%CO2，复氧条件为20.9%O2、5%CO2。

1.2.4 CCK-8检测 原代分离神经元，接种至96孔板内，每孔接种5000个细胞，每组3孔重复，接种5 d后构建糖氧剥夺细胞模型，另取3孔未接种细胞的空白孔加入100 μL无糖基础培养基作为空白组。作用完后每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养箱内孵育2 h后酶标仪450 nm波长下检测吸光度。细胞活力%=(实验孔OD-空白孔OD)/(正常细胞孔OD-空白孔OD)×100%。

1.2.5 流式细胞术检测 细胞凋亡检测原代分离神经元细胞接种至6孔板内，每孔接种105个细胞，每组3孔重复，接种5 d后构建糖氧剥夺细胞模型。作用完后0.25%胰酶消化收集细胞，PBS洗3次，100 μL流式凋亡结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC染色液和5 μL PI染色液后混匀，室温避光孵育15 min后用PBS将液面补至1 mL。用流式细胞仪分析计算神经元细胞凋亡率。

1.2.6 酶联免疫吸附测定(ELISA) 检测神经元ROS 取50 μL神经元培养上清加入96空板中；除空白孔外，每孔加酶标试剂100 μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃孵育1 h。弃去孔内液体，甩干，每孔加350 μL洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀， 37℃避光显色15 min。依次每孔加终止液50 μL，终止反应。以空白孔调零，在反应终止15分钟内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。使用ELISA calc软件根据神经元细胞浓度和OD值做出标准曲线并计算回归方程，根据所得回归方程即可算出样本中ROS的含量。

1.2.7 Western blot实验检测 ROS/TXNIP/NLRP3信号通路相关蛋白的表达水平将培养并进行相应干预的细胞置于裂解液中裂解 30 min，冰上匀浆后 12000×g 离心10 min，获取上清液，利用 BCA 蛋白质定量试剂盒检测蛋白的浓度。取 50 μg 蛋白，煮沸变性后上样，依次进行SDS-PAGE分离、转膜、封闭，分别加入稀释的NLRP3(Bioss,1∶1000)、ASC(Bioss,1∶1000)、TXNIP(Abcam,1∶1000)、caspase-1(Bioss,1∶1000)、IL-18(Bioss,1∶1000)、IL-1β(Bioss,1∶1000)一抗抗体，4℃孵育过夜;以TBST清洗 5 min，清洗3次; 加入HRP标记羊抗兔IgG (H+L) 二抗室温孵育60 min;以TBST 清洗5 min，清洗3次; 避光ECL显色，凝胶成像系统进行拍照。采用ImageJ 5.0软件分析图像灰度值。

2 结果

2.1 成功培养SD大鼠离体皮质神经元 神经元培养后24 h开始长出小的突起，培养5天，突起较为明显，具有明显的神经元形态(见图1A)。经免疫荧光染色后发现，培养的神经元表达神经元特异性标志物NeuN(见图1B)，表明我们成功培养了SD大鼠离体皮质神经元。见图1。

图1 培养的SD大鼠皮质神经元Figure 1 Cortical neurons of SD rat注：A.培养5天SD大鼠皮质神经元形态；B.培养SD大鼠皮质神经元表达神经元特异性标志物NeuN；C.DAPI染培养神经元细胞核；D.B～C图片叠加

2.2 依达拉奉对皮质神经元细胞活性的影响 按实验分组处理皮质神经元细胞，并通过CCK-8检测不同时间点细胞活性变化结果，与正常神经元组相比，糖氧剥夺后神经元细胞增殖活力显著降低(P<0.001)，依达拉奉处理后明显提高糖氧剥夺组神经元活力，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

图2 依达拉奉对皮质神经元活力及凋亡率的影响Figure 2 Cultured cortical neurons of SD rats注：A.糖氧剥夺前后依达拉奉处理对皮质神经元活力的影响；B.糖氧剥夺前后依达拉奉处理对皮质神经元凋亡率的影响。①P<0.01，②P<0.001

2.3 各组细胞凋亡率 正常神经元组、糖氧剥夺组、依达拉奉处理组、糖氧剥夺+依达拉奉处理组细胞凋亡率分别为(0.877±0.112)%、(32.103±6.221)%、(1.537±0.631)%和(15.673±3.242)%。结果显示在缺糖缺氧状态下神经元细胞凋亡率明显升高(P<0.001)，与糖氧剥夺组相比，经依达拉奉处理后，神经元的凋亡率明显降低(P<0.001)，凋亡得到明显改善。

2.4 依达拉奉对皮质神经元细胞ROS水平的影响 按实验分组以ELISA试剂盒检测神经元培养上清ROS含量，结果表明糖氧剥夺后神经元ROS水平显著上升，依达拉奉处理后神经元产生ROS含量又显著下降(见图3B)。表明依达拉奉能够降低糖氧剥夺情况下皮质神经元ROS的产生。

2.5 依达拉奉对ROS/TXNIP/NLRP3信号通路的影响 培养神经元以Western blot 检测细胞内 ROS/TXNIP/NLRP3信号通路相关蛋白表达。结果显示，神经元缺氧后IL-1β蛋白(图3C)、TXNIP蛋白(图3D)、IL-18蛋白(图3E)、Caspase-1蛋白(图3F)、ASC蛋白(图3G)和NLRP3蛋白(图3H)表达水平均显著上升，但在进行依达拉奉处理后又显著下降(P<0.01)。

图3 依达拉奉对皮质神经元的影响Figure 3 Effects of edaravone on cortical neurons注：A.依达拉奉处理前后不同处理组皮质神经元免疫印迹实验；B.糖氧剥夺前后依达拉奉处理对皮质神经元ROS水平的影响；C.糖氧剥夺前后依达拉奉处理对皮质神经元IL-1β蛋白表达的影响；D.糖氧剥夺前后依达拉奉处理对皮质神经元TXNIP蛋白表达的影响；E.糖氧剥夺前后依达拉奉处理对皮质神经元IL-18蛋白表达的影响；F.糖氧剥夺前后依达拉奉处理对皮质神经元caspase-1蛋白表达的影响；G.糖氧剥夺前后依达拉奉处理对皮质神经元ASC蛋白表达的影响；H.糖氧剥夺前后依达拉奉处理对皮质神经元NLRP3蛋白表达的影响。①P<0.05，②P<0.01，③P<0.001

3 讨论

多数临床研究证实，氧化应激及炎症反应是介导缺血性脑损伤的两大病理生理机制，抑制缺血后的氧化应激及炎症反应可能是治疗缺血性脑损伤的重要靶点[10]。已有研究表明，依达拉奉可以显著减少梗死体积并缓解神经功能缺损，并通过减少氧化应激和炎症发挥神经元保护作用[11-14]。本研究结果显示，糖氧剥夺后神经元活力显著降低，凋亡率显著上升，经依达拉奉处理后，神经元的凋亡情况得到明显改善。说明依达拉奉对神经元糖氧剥夺损伤的具有神经保护作用，与以往的研究结论一致。另外，目前研究认为依达拉奉通过减少ROS、脂质过氧化和VEGF水平诱导内皮细胞增殖[15]，并且通过抑制氧化应激反应来发挥作用[16]。在本研究中，缺氧损伤后，神经元氧化应激水平显著上升，依达拉奉处理后神经元氧化应激水平又显著降低，也说明了依达拉奉对神经元氧化应激反应的抑制，与上述研究结果一致。

R0S/TXNIP/NLRP3 信号通路作为氧化应激和炎症反应的重要信号通路之一，参与了多种疾病的发生发展[17-18]，但R0S/TXNIP/NLRP3 信号通路在脑缺血/再灌注性脑损伤中的研究较少。脑缺血时氧化呼吸链受损产生的活性氧自由基(ROS)可以通过硫氧还蛋白互动性蛋白(TXNIP)相互之间解离并结合于Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)，进而激活NLRP3[19]。NLRP3炎症小体由NLRP3/ASC/Caspase-1/IL-1β、II-18构成，NLRP3/ASC/Caspase-1级联通路激活后，促进IL-1β、IL-18的合成和释放并造成脑组织发生炎症损伤[20-21]，介导脑缺血神经元和神经胶质细胞的凋亡和“焦亡”。本研究中采用依达拉奉后处理大鼠糖氧剥夺损神经元，我们检测了各组神经元细胞中NLRP3、ACS、TXNIP、Caspase-1、IL-8和IL-1β蛋白的表达变化情况。结果显示ROS含量及 TXN1P 、NLRP3 、 ASC和 caspase-1 蛋白水平显著降低，且血清炎症因子及脑组织氧化应激指标也显著变化，因此我们认为依达拉奉能够降低大鼠糖氧剥夺损神经元中R0S 的含量，抑制TNXIP/NLRP3 等炎性小体相关蛋白的聚集及激活，抑制下游氧化应激指标及炎症因子的释放，从而抑制组织细胞的凋亡，减轻脑组织损伤，提高脑缺血耐受，从而降低神经元损伤。

4 小结

依达拉奉后处理能够抑制ROS/TXNIP/NLRP3信号通路，有效减轻大鼠糖氧剥夺损神经元损伤，这可能是依达拉奉发挥脑神经保护作用的机制之一。也为临床治疗缺血性脑梗死提供了一定的参考。