基于牡丹皮微观性状与抗炎活性相关的“辨状论质”研究

陈依婷，王冰，孙艳涛，王诗雨，吴俊英

（辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600）

“辨状论质”是指根据药材性状的特点判断药材的真伪优劣［1］。中药的“状”既包括宏观特征，如中药材的形、色、表面和质地等，也包括微观特征，即中药显微特征［2］。目前国内外“辨状论质”机制的研究较少，囊括的药材仅30余种，大多基于药材的宏观特征，运用感官技术来进行“辨状论质”研究［3－5］。质量评价方面，大多是研究药材性状与所含化学成分含量之间相关性［6］，而一种或几种化学成分的活性并不能完全代表药材的整体药效，因此根据活性成分的含量判断中药质量有一定的片面性。本实验选择牡丹皮为研究对象，通过研究其显微特征和抗炎药理活性，考察二者之间存在的相关性，为牡丹皮“辨状论质”研究提供参考依据。

牡丹皮为毛茛科芍药属植物牡丹（Paeonia suffruticaosaAndr.）的干燥根皮［7］。牡丹皮有清热凉血、活血化瘀的功效，可令血流畅而不留瘀，血热清而不妄行，用于热入营血、温毒发斑、吐血和衄血等［8］。临床也可用于降血糖、抗菌消炎、抗动脉粥样硬化等［9］。当前国内有关牡丹皮“辨状论质”机制的研究甚少，国外对牡丹皮的研究多是基于内生细菌的多样性分析、对牡丹皮代谢产物进行质量评价等［10－11］，未见涉及牡丹皮“辨状论质”的研究。牡丹皮粉性足，气芳香，其所含淀粉粒及草酸钙簇晶众多，且簇晶直径9～45 μm，排列成行，是牡丹皮最具特色的显微特征［12］。前期实验发现，牡丹皮粉末中草酸钙簇晶显微特征明显且易于计数［13］，极具代表性。牡丹皮的抗炎活性现代应用较为广泛［14］，因此本实验选择抗炎活性作为牡丹皮药效的研究。通过对二者的相关性分析，揭示牡丹皮基于微观性状与抗炎活性的“辨状论质”内涵。

1 仪器与试材

1.1 仪器

生物显微镜（Nikon E100）；TD 型电子天平（余姚市金诺天平仪器有限公司）；高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；微量移液器（Thermo 赛默飞F2系列单道移液器）；足肿胀测定仪（KW－7C）；软尺。

1.2 主要试剂

水合氯醛（天津大茂化学试剂厂，批号：302－17－0，分析纯）；甘油（商丘圣邦生物科技有限公司，批号：190202）；角叉菜胶（Simga，批号：127H1227）；乙酰水杨酸（纯度＞91%，HPLC）由辽宁中医药大学有机化学实验室提供。

1.3 实验材料

牡丹皮药材经辽宁中医药大学药学院康廷国教授鉴定均为正品药材，见表1。健康小鼠250 只，雌雄各半，体质量18～22 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物生产许可证编号：SCXK（辽）2020－0001。

表1 22批牡丹皮药材产地

2 方法与结果

2.1 牡丹皮的显微特征

2.1.1 均匀设计实验

采用三因素六水平均匀设计实验来确定最佳实验条件，见表2。取1号牡丹皮药材粉碎，按均匀设计实验表分别过80目、100目筛，精密称定50、80、120、150、180、200 mg共6份样品于10 mL容量瓶中，加入相应的甘油量后，用水合氯醛定容，摇匀，用微量移液器吸取50 μL于载玻片上，盖好盖玻片。6份溶液各平行装片50张，在生物显微镜下观察簇晶并计数。将所得结果平均分为5组并取平均值，计算每组平均值的RSD，见表3。

表2 均匀设计实验表

表3 均匀设计结果

设Y为RSD%值，X1为样品重量，X2为药材粉碎粒度，X3为甘油量。根据均匀设计结果可得：Y=117.760－0.937X2，R= 0.966，F= 55.063，Ymin =24.06。由此可知，影响RSD值的主要因素为X2粉碎粒度，X1、X3与Y无明显相关性，可依实验情况而定。为降低RSD值，最佳水平组合条件为：样品重量120 mg，粉碎粒度100目，加入甘油2 mL。

2.1.2 牡丹皮中显微特征指数的测定

取22 批牡丹皮药材粉末过100 目筛，精密称定120 mg药粉于10 mL容量瓶中，精密加入2 mL甘油，用水合氯醛定容，摇匀，用微量移液器吸取50 μL 于载玻片上，盖好盖玻片，每份溶液平行纸片50 张，于显微镜下观察簇晶，计数，所得结果分为5组并取每组平均值，按照公式（1）计算［15］，结果用均数±标准差（±s）表示，所得数据见表4。可以看出个别批次的牡丹皮显微特征指数明显较高，有的牡丹皮显微特征指数区间相近。

表4 牡丹皮显微特征指数测定结果（±s）

表4 牡丹皮显微特征指数测定结果（±s）

样品号显微特征指数（个/mg）显微特征指数（个/mg）1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 343±270 1 307±289 1 632±190 1 484±278 1 088±285 1 276±260 1 396±338 1 293±276 1 361±313 1 305±224 1 523±321样品号12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 706±309 1 831±217 2 188±433 1 445±257 2 016±407 1 636±343 2 681±663 1 856±170 2 023±319 1 461±332 1 597±293

其中，P：定量药材显微特征指数（个/mg）；X：每片盖玻片下药材显微特征数；V：定量药材混悬液总体积（mL）；V'：盖玻片下药材混悬液体积（mL）；W：药材重量（mg，按干燥品计）。

2.1.3 牡丹皮簇晶数据聚类分析

以簇晶数据为变量，采用系统聚类法对不同来源的牡丹皮进行聚类分析，所得垂直冰柱图见图1。

图1 牡丹皮簇晶数据垂直冰柱图

当群集数为5时，22批牡丹皮被划分为5类：第Ⅰ类群包括11个品种，编号分别为1、2、4、6、7、8、9、10、11、15、21；第Ⅱ类群仅1 个品种，编号为5；第Ⅲ类群包括6 个品种，编号分别为3、12、13、17、19、22；第Ⅳ类群包3个品种，编号分别为14、16、20；第Ⅴ类群仅1个品种，编号为18。将显微特征指数测定值与聚类分析结合，按照显微特征指数测定值高低分出5 个类群的大小排列：Ⅴ＞Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ。

2.2 牡丹皮抗炎活性测定

2.2.1 供试品溶液制备

取22 批牡丹皮药材适量，分别加5 倍量75%乙醇，回流提取2 次，过滤，合并滤液，减压浓缩，得到牡丹皮流浸膏［16］。

2.2.2 牡丹皮抗炎情况测定

小鼠250 只，随机分为25 组，每组10 只，分别为空白组、模型组、给药组1～22组和阳性组［17］。其中，各给药组小鼠分别灌胃给予22 批牡丹皮提取液0.6 g/mL，阳性组小鼠灌胃阳性对照品阿司匹林溶液0.125 g/mL［18］。连续灌胃4 d，最后1次灌胃40 min后，除空白组外，对其余各组小鼠采用左后足趾处注射1%角叉菜胶混悬液0.05 mL 的方法建立炎性小鼠模型［19］，空白组小鼠于同部位注射等量生理盐水。于造模前及造模5、30 min和1、2、4 h后测量各组小鼠左足踝关下0.5 mm 处的周长［20］。足肿胀抑制率用造模后相对于造模前周长的增加值表示［21］。结果见表5，可以看出个别牡丹皮的抑制率较高，有的牡丹皮的抑制率区间相近。

表5 不同批牡丹皮足肿胀抑制率结果（±s）

表5 不同批牡丹皮足肿胀抑制率结果（±s）

样品号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11抑制率（%）39.54±31.82 39.80±36.97 46.11±26.90 75.04±17.88 63.48±20.13 68.84±26.24 73.71±36.23 31.80±39.73 81.61±49.81 49.95±26.61 61.74±19.09样品号12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22抑制率（%）58.93±22.94 65.51±23.69 60.72±26.27 60.76±39.04 80.89±24.69 73.27±33.00 97.76±37.50 52.59±25.84 96.41±19.36 60.86±34.06 89.14±24.62

足肿胀抑制率=（对照组足平均肿胀度－给药组足平均肿胀度）/对照组足平均肿胀度×100%

2.2.3 牡丹皮抗炎情况聚类分析

以抗炎数据为变量，采用系统聚类法对不同产地的牡丹皮进行聚类分析，所得垂直冰柱图如图2所示。

图2 牡丹皮抗炎情况垂直冰柱图

当群集数为5时，22批牡丹皮被划分为5类：第Ⅰ类群包括3 个品种，编号分别为1、2、8；第Ⅱ类群包括3个品种，编号为3、10、19；第Ⅲ类群包括11个品种，编号分别为4、7、17、6、5、13、11、14、15、21、12；第Ⅳ类群包括3 个品种，编号分别为9、16、22；第Ⅴ类群包括2 个品种，编号为18、20。将足肿胀抑制率数值与聚类分析结合，按照足肿胀抑制率高低分出5 个类群的大小排列：Ⅴ＞Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ。

2.3 牡丹皮簇晶显微特征指数与抗炎药效相关性研究

运用SPSS 17.0 软件，对簇晶显微特征指数与足肿胀抑制率进行Pearson 相关性分析，结果如下：相关系数R= 0.518，变量呈中等程度正相关；P= 0.007 ＜0.01，变量相关性显著。可以看出不同来源牡丹皮药材簇晶显微特征指数与其足肿胀抑制率呈显著中等程度正相关，即簇晶显微特征指数越大，足肿胀抑制率越高。

3 小结与讨论

本实验基于牡丹皮显微特征（簇晶）与抗炎活性的相关性分析来评价阐释“辨状论质”理论机制。相关性分析结果中，不同来源牡丹皮中簇晶显微特征指数与抗炎活性有较显著的相关性，呈中度正相关，中药的药理活性直接反映药材的优劣，说明牡丹皮簇晶的显微特征指数可作为判断药材品质优劣的参考指标。聚类分析结果中，山东青岛的牡丹皮药材（编号18）中簇晶的显微特征常数明显多于其他来源，其抗炎药理作用也较其他来源的牡丹皮较为显著，说明产于山东青岛的牡丹皮品质较优，在牡丹皮的使用中可以优先考虑该来源。其余的21 个品种中，相同产地的大都分为一类，说明来源相同的牡丹皮质量基本保持一致。

本实验对微观性状－簇晶进行了研究，拓展了中药“辨状论质”理论中“状”的范围，即中药的“状”既包括药材宏观性状，也应包括微观性状，即药材的显微特征。通过“状－效”关联研究，表明药材的显微特征与药理活性存在关联，可以通过定性定量测定药材性状判别药材品质，可为中药“辨状论质”科学内涵的研究提供参考依据。