EGFL6促进胃癌细胞增殖、侵袭及转移能力

门 慧，谈 顺

我国胃癌的发病率及病死率均较高，分别位居恶性肿瘤发病率和病死率的第2位和第3位，患者5年生存率约35.1%，严重危害人类健康[1-2]。类表皮生长因子域属于EGF重复超级家族，其中EGFL6是重要成员之一，又被命名为MAGE[3-4]。EGFL6与多种肿瘤密切相关，可以通过刺激肿瘤血管形成进而促进卵巢癌[5-7]、乳腺癌[8]的侵袭及转移。本组前期实验已证实EGFL6在胃癌组织中高表达，与胃癌患者预后呈负相关，并能促进胃癌血管形成[9]。本文着重探讨EGFL6表达在胃癌细胞增殖、侵袭及转移过程中的作用，以提高临床与病理医师的认识水平。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2014～2016年中南大学湘雅医学院附属海口医院存档的40例胃癌手术标本，患者术前均未接受放、化疗，男性21例，女性19例，年龄39～58岁，中位年龄48.5岁。另选取距癌组织5 cm以上的癌旁正常胃黏膜组织作为对照。

1.2 细胞及试剂胃癌细胞株来自中南大学湘雅医学院附属海口医院，RPMI-1640培养基、胎牛血清购自Invitrogen公司，胰酶购自Life公司，EGFL6抗体购自Abcam公司，CCK-8试剂盒购自碧云天生物公司，Boyden小室购自美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1细胞培养 人胃癌细胞株(MGC803/MOCK、MGC803/EGFL6)置于10%FBS的RPMI-1640培养基，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3.2CCK-8实验 选取状态良好的胃癌细胞株，消化细胞株铺96孔板，每孔铺1×103个细胞，每孔总体积100 μL；每组设计5个目的复孔，1个blank对照孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱连续培养7天。铺板24 h后于酶标仪中测450 nm处各孔吸光度值(OD值)，连测7天，最后绘制增殖曲线。

1.3.3Transwell实验 选取状态良好的胃癌细胞株，Boyden小室预处理：小室滤膜铺基质胶(每小室50 μL)，置于超净台紫外照射2 h杀菌，消化细胞株，上室加入200 μL细胞悬液(细胞数2.0×105个)，下室加入10%胎牛血清RPMI-1640培养基600 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱连续培养48 h，取出小室，进行清洗、固定、染色，显微镜下计数穿过小室膜细胞数，200倍光镜下随机取上、下、左、右、中心5个视野进行计数，拍图，并取其均值。

1.3.4裸鼠肺定植实验 2组4～6周龄裸鼠，每组5只，每只尾静脉注射5×106个细胞，28天后解剖裸鼠，取其肺脏并观察肺转移情况，10%中性福尔马林固定标本、取材、包埋、制片，光镜下观察肿瘤细胞的肺转移情况。

1.3.5免疫组化 免疫组化染色采用SP法，提前烤石蜡切片6～8 h，脱蜡、脱水、抗原修复、阻断灭活内源性过氧化物酶、血清封闭、加入一抗4 ℃冰箱过夜、生物素标记二抗、加入辣根过氧化物酶工作液、DAB显色、染色及制片。判读标准：(1)根据阳性细胞着色程度计分：未着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；(2)根据阳性细胞百分比计分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；将两项得分结果相加：3～4分为阴性，5～7分阳性。

1.4 统计学分析采用Graphpad Prism 6.0软件进行统计学分析，两组均数间比较用配对样本t检验，生长时间、增殖能力、时间与分组之间比较用析因方差分析，免疫组化结果与临床参数的相关性分析用χ2检验。α=0.05为检验标准。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织中EGFL6蛋白表达免疫组化检测显示，EGFL6蛋白表达定位于细胞质(图1)，胃癌组织中28例EGFL6蛋白阳性(70%，28/40)，癌旁正常胃黏膜组织中5例EGFL6蛋白阳性(12.5%，5/40)，与癌旁正常胃黏膜组织相比，胃癌组织中EGFL6的表达量明显上调(χ2=27.29，P<0.001)。

图1 EGFL6在胃癌及癌旁组织中的表达，SP法：A.胃癌组织中阳性；B.癌旁正常胃黏膜组织中阴性

2.2 胃癌组织中EGFL6表达与临床病理特征的关系EGFL6表达与胃癌患者性别、年龄、肿瘤直径无相关性，与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有相关性(P均<0.05，表1)。

表1 胃癌组织中EGFL6表达与临床病理特征的关系

2.3 过表达EGFL6后MGC803细胞的增殖能力变化MGC803/MOCK组与MGC803/EGFL6组相比，细胞株生长时间差异有显著性(F=290.9，P<0.000 1)，细胞增殖能力差异有显著性(F=572.3，P<0.000 1)，时间与分组之间的交互效应显著(F=40.45，P<0.000 1)。结果表明，过表达EGFL6后细胞增殖速度明显增加，提示EGFL6表达促进肿瘤细胞体外增殖能力(表2，图2)。

表2 CCK-8实验检测过表达EGFL6后对MGC803细胞增殖的影响

图2 CCK-8实验检测过表达EGFL6后MGC803细胞株的体外增殖情况

2.4 过表达EGFL6后MGC803细胞的侵袭能力变化与MGC803/MOCK组相比，MGC803/EGFL6组穿过小室膜细胞数目明显增多(t=11.34，P<0.000 1)。结果表明，EGFL6表达促进胃癌细胞的体外侵袭能力(图3)。

图3 Boyden小室侵袭实验检测过表达EGFL6后MGC803细胞株的体外侵袭情况

2.5 过表达EGFL6后MGC803细胞的肺定植能力变化与MGC803/MOCK组相比，MGC803/EGFL6组肺转移灶数目明显多于对照组(t=6.200，P=0.000 3)。结果表明，过表达EGFL6可增强胃癌细胞的体内肺转移能力(图4)。

图4 裸鼠尾静脉肺定植实验检测过表达EGFL6后MGC803细胞株体内肺转移情况：A.肺转移结节大体图；B.肺转移结节镜下图；C.肺转移灶统计图

3 讨论

EGFL6属于EGF重复超级家族，包涵1个N端信号肽，属于一种分泌蛋白，研究发现其参与细胞周期、增殖、发育调节、血管形成及肿瘤演进等[10-12]。文献已报道，EGFL6可以调控ALDH+卵巢癌细胞的不对称分裂、生长和转移[5]，EGFL6通过CRISPR/Cas9信号通路调控卵巢癌增殖、侵袭及血管形成[6]，miR-6086通过下调OC2/VEGFA/EGFL6轴抑制卵巢癌血管生成[7]。EGFL6可以增强癌细胞转移能力及刺激肿瘤血管形成，促进乳腺癌的进展[8]。EGFL6可以作为肺腺癌预后标志物[13]。EGFL6在结直肠癌中高表达并通过Wnt/β-catenin信号通路促进结直肠癌增殖和迁移[14-15]；EGFL6促进食管癌增殖、侵袭和迁移[16]。EGFL6通过AKT信号通路，促进鼻咽癌生长及转移[17]；EGFL6在胃癌组织中高表达[9,18]；EGFL6能够促进胃癌血管形成[9]。肿瘤微环境是肿瘤细胞生命活动的场所，血管可以源源不断提供营养成分[19-20]，促进肿瘤细胞的发生、发展。

本组前期实验已证实EGFL6 mRNA在胃癌组织中高表达并与患者预后呈负相关，通过旁分泌EGFL6蛋白刺激胃癌血管形成[9]，肿瘤发展过程中需要足够丰富的血管源源不断提供营养支持，胃癌细胞通过自身旁分泌EGFL6蛋白刺激血管形成，为其提供足够的养分。因此，本实验进一步探究EGFL6是否在胃癌细胞侵袭、转移中也发挥着重要作用。

本组免疫组化结果显示，EGFL6蛋白在胃癌组织中高表达，其表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关。过表达EGFL6后，胃癌细胞MGC803增殖、侵袭及裸鼠尾静脉肺定植能力均增强，说明EGFL6与胃癌的增殖、侵袭及转移密切相关。结合本组前期实验结果，可以得出胃癌细胞通过自身旁分泌EGFL6蛋白，刺激胃癌血管形成，进一步促进胃癌侵袭、转移，为临床抗肿瘤治疗提供新的靶向参考，具体作用机制还有待深入探究。