IL-32通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制胃癌细胞自噬

王雪梅，程 玉，齐洁敏

2020年WHO国际癌症研究机构(IARC)最新数据显示，胃癌的发病率和致死率均位居恶性肿瘤的第4位，病死率高达7.7%[1]。中国是胃癌的高发地区，约为全球平均水平的2倍，发现时常已为中晚期，治疗手段较局限，且其转移和复发率高，术后5年生存率仅为20%，严重威胁人类健康[2]。胃癌的发生机制错综复杂，不仅与异常增殖、凋亡相关，与自噬亦密不可分。自噬是一个维持细胞正常生理功能、促进DNA损伤修复、调节恶性肿瘤转移，进而高度精确调控肿瘤形成的过程[3-4]。IL-32作为肿瘤微环境中的一种炎症因子，与胃癌的发生、发展紧密相连，对于调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等具有重要作用[5]，但是否通过自噬影响此类现象还有待探究。本文旨在探究IL-32对胃癌细胞自噬的影响及可能的作用机制，为胃癌的精准治疗开辟新路径。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备CO2培养箱、超低温冰箱、纯水机(美国Thermo Scientific公司)，荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)，电泳仪、转膜仪及凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司)，制冰机(日本SANYO公司)；摇床(北京六一生物公司)。

1.2 主要试剂人胃癌细胞株MGC-803、AGS、BGC-823、SGC-7901和正常胃上皮细胞GES-1购自中国科学院上海细胞库。RPMI-1640培养基、DMEM/F12(1∶1)培养基、特级胎牛血清(美国Gibco公司)，IL-32 siRNA(广州锐博生物公司)，转染试剂Lipo3000(美国Invitrogen公司)，BCA蛋白定量试剂盒(北京索莱宝公司)，GAPDH内参抗体(美国Cell Signal公司)，Goat Anti-Mouse IgG-HRP和Goat Anti-rabbit IgG-HRP(美国KPL公司)，IL-32、p-mTOR、mTOR、p-AKT、AKT抗体(美国Affinity Biosciences公司)、p110α、p85α、p62、Beclin1、LC3抗体(中国武汉三鹰生物公司)。

1.3 方法

1.3.1细胞培养 本实验选择1株正常胃黏膜上皮细胞GES-1和4株胃癌细胞MGC-803、AGS、BGC-823、SGC-7901。其中GES-1、MGC-803、BGC-823、SGC-7901细胞使用10%RPMI-1640培养基，AGS细胞使用10%F12培养基，在5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。更换培养基依据细胞生长状态而定，待细胞密度达90%以上时，根据实验所需进行传代、种板以及冻存，取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3.2细胞转染 转染前一天下午将对数生长期的细胞接种至6孔板中，保证转染时细胞密度在50%左右，按实验设计分别转染siNC、siIL-32#1及siIL-32#2组(siIL-32#1：5′-GGGAGAGCUUUU GUGACCA-3′，siIL-32#2：5′-CGGCUUAUUAUGAG GAGCA-3′)。稀释转染试剂：将4 μL Lipo3000试剂溶于125 μL无血清培养基中，室温静置5 min；稀释siRNA：将7.5 μL siRNA储存液溶于125 μL无血清培养基中，混匀，将稀释后的siRNA加入稀释后的转染试剂中，静置15 min。取前一天接种的6孔板，弃掉旧培养基，1 mL PBS清洗2次，每孔加入2 mL无血清培养基，再对应加入250 μL转染复合物溶液，轻微摇匀，置于5%CO2、37 ℃的培养箱中培养，6～8 h后更换为10%的完全培养基继续培养。

1.3.3免疫荧光技术 取转染24 h后的细胞进行细胞爬片，将爬片置于24孔板中，分别对应加入100 μL细胞悬液，然后加入600 μL 10%完全培养基，置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养24 h后取出，弃上清，PBS洗5 min×3次。预冷的4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗5 min×3次。2%BSA封闭液封闭2 h。弃封闭液，加入一抗LC3(稀释比1∶50)，4 ℃孵育过夜。次日取出，PBS洗5 min×3次。孵育荧光二抗(稀释比1∶100)，37 ℃避光孵育2 h，PBS洗5 min×3次。DAPI复染细胞核，室温避光孵育5 min，PBS洗5 min×3次。进行封片，立即在荧光显微镜下进行拍照观察。

1.3.4Western blot法检测蛋白表达 收集转染48 h后细胞，在冰上用细胞裂解液(RIPA裂解液∶蛋白酶抑制剂∶磷酸酶抑制剂=100∶1∶1)，提取各组细胞总蛋白，蛋白浓度采用BCA法蛋白定量试剂盒进行测定，配好蛋白样本后，100 ℃变性8 min。配制10%分离胶及5%浓缩胶，采用SDS-PAGE凝胶电泳，以30 μg/15 μL体系加样进行电泳，175 mA转膜1.5 h，5%奶粉或5%BSA封闭液封闭2 h，孵育一抗(抗体稀释比1∶1 000)，4 ℃过夜。次日取出，TBST洗10 min×3次。二抗37 ℃孵育1 h(抗体稀释比1∶10 000)，TBST洗10 min×3次。ECL超敏发光显色试剂盒显色，使用Image J分析灰度值。

2 结果

2.1 胃癌细胞系中IL-32的表达Western blot法检测胃癌细胞系MGC-803、AGS、BGC-823、SGC-7901及胃正常上皮细胞系GES-1中IL-32的表达。与GES-1(0.704±0.024)相比，MGC-803(1.267±0.085)、AGS(1.269±0.047)细胞中IL-32蛋白明显高表达，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。后续实验均采用此两株细胞进行基因沉默。

图1 Western blot法检测胃癌细胞株MGC-803、AGS、BCC-823、SGC-7901和胃正常上皮细胞株GES-1中IL-32蛋白的表达：与GES-1相比，MGC-803和AGS细胞中IL-32蛋白显著高表达，***P<0.001

2.2 IL-32沉默效率为确保实验的严谨性，应用Western blot法对转染效率进行观察和验证。在MGC-803和AGS细胞中，与阴性对照组(siNC)(1.071±0.029、1.071±0.029)相比，siIL-32#1组(0.482±0.018、0.478±0.038)和siIL-32#2组(0.473±0.01、0.525±0.026)蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。后续所有实验均在保证转染效率的前提下进行。

图2 Western blot法验证siRNA转染效率：与siNC组相比，siIL-32#1和siIL-32#2组蛋白表达水平显著降低，***P<0.001

2.3 沉默IL-32基因对胃癌细胞自噬的影响MGC-803、AGS细胞分别转染IL-32 siRNA，荧光显微镜下观察并定量LC3荧光斑点。与siNC组相比，转染siIL-32#1和siIL-32#2的胃癌细胞MGC-803和AGS细胞的LC3荧光斑点数量显著增多，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。说明沉默IL-32基因可促进胃癌细胞发生自噬。

图3 沉默IL-32基因对胃癌细胞自噬的影响：与siNC组相比，转染siIL-32#1和siIL-32 #2的胃癌细胞MGC-803和AGS中自噬荧光斑点量显著增多，***P<0.001

2.4 IL-32对自噬相关蛋白表达的影响转染siIL-32#1和siIL-32#2的胃癌细胞MGC-803中p62的相对表达量为0.244±0.051和0.339±0.025，其在AGS细胞中的相对表达量(0.427±0.028、0.392±0.033)明显低于siNC组(0.948±0.015、1.056±0.043)。Beclin1(MGC-803：0.783±0.047、0.921±0.021；AGS：0.973±0.034、1.085±0.082)、LC3-Ⅱ(MGC-803：1.080±0.015、1.006±0.024；AGS：0.826±0.083、0.777±0.174)与siNC组(MGC-803：0.948±0.015、0.948±0.015；AGS：0.647±0.039、0.223±0.038)相比表达升高，差异有统计学意义(P<0.05，图4)。

图4 Western blot法检测自噬相关蛋白的表达：与siNC相比，MGC-803和AGS细胞转染IL-32 siRNA后，siIL-32#1组和siIL-32#2组p62表达降低，Beclin1和LC3-Ⅱ表达升高，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.5 IL-32对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响转染siIL-32#1和siIL-32#2的胃癌细胞MGC-803中p-mTOR/mTOR的相对表达量为0.298±0.037和0.352±0.034，在AGS细胞中的相对表达量为0.492±0.011和0.425±0.039，明显低于siNC组(0.870±0.032和0.933±0.052)。p-AKT/AKT(MGC-803：0.330±0.013、0.432±0.028；AGS：0.582±0.016、0.482±0.043)，p110α(MGC-803：0.714±0.022、0.901±0.030；AGS：0.504±0.023、0.550±0.008)，p85α(MGC-803：0.296±0.023、0.642±0.063；AGS：0.364±0.030、0.417±0.046)较siNC组(MGC-803：1.130±0.030、1.061±0.026、1.144±0.024；AGS：1.177±0.018、1.058±0.017、1.075±0.027)表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，图5)。

图5 Western blot法检测PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达：与siNC组相比，MGC-803和AGS细胞转染IL-32 siRNA后，siIL-32#1和siIL-32#2组p-mTOR、p-AKT、p110α、p85α表达水平明显降低，而mTOR和AKT总蛋白水平保持不变或略升高，**P<0.01，***P<0.001

3 讨论

白介素(interleukin, IL)家族是人类机体免疫系统中重要的调节因子，由巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞和内皮细胞等多种细胞分泌而成，可根据其性质分为趋化因子、炎症因子和其他因子三类，IL家族成员参与众多炎症性疾病和恶性肿瘤的形成。相关研究表明[6-8]，IL家族种类多样，功能复杂，IL-1β可通过自噬作用调控非小细胞肺癌的形成；在胆管癌的预后治疗中，IL-6可通过自噬过程发挥诊断作用；IL-12可促进肝细胞的凋亡和自噬，从而抑制肝癌的发生与发展；王丽华等[9]研究还发现，IL-17A可以通过调节自噬降低卵巢癌细胞的敏感性。

IL-32是IL家族中重要一员，位于人类第16号染色体上，由705个碱基对构成，相对分子质量为3.2×104，IL-32在恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的调控作用[5,10]。研究表明，IL-32在肺癌[11]、肝癌[12]、结直肠癌[13]、食管癌及胃癌[14]等恶性肿瘤中均呈高表达，但其具体的作用机制是否与自噬相关目前尚不清楚。炎症和自噬与恶性肿瘤的发病机制均具有相关性，机体的适度自噬在能量代谢、免疫调控以及细胞分化过程中发挥重要作用，而自噬失调可导致细胞营养匮乏，无法发挥正常的生理功能，从而加速细胞死亡[15]。LC3是自噬的标志蛋白，在激活状态下，LC3-Ⅰ会与磷脂酸乙醇胺结合成为LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ进一步与泛素结合支架蛋白p62结合形成复合物，导致自噬溶酶体不能被降解，自噬过程受损[16-17]。

为探索IL-32对胃癌细胞自噬的影响，本实验选用2条siRNA链转染MGC-803和AGS细胞，通过免疫荧光技术进行检测，结果显示：沉默IL-32可增加LC3荧光斑点的数量，促进胃癌细胞发生自噬；采用Western blot法检测自噬相关蛋白结果显示：与siNC组相比，siIL-32#1和siIL-32#2组p62表达降低，而Beclin1、LC3-Ⅱ表达升高。这些结果表明IL-32抑制胃癌细胞发生自噬。

PI3K/AKT/mTOR信号通路在抑制自噬调控过程中发挥关键作用[18]。PI3K/AKT信号通路是细胞发生自噬的重要调控途径[19]，PI3K由p85调节亚基和p110催化亚基构成，PI3K可磷酸化AKT，进而激活下游基因mTOR，其是自噬信号通路的主要靶点，促进mTOR与自噬相关因子丝氨酸激酶1相互作用，最终触发自噬[20]。本实验通过Western blot法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路上的PI3K亚基p110α和p85α以及下游蛋白p-AKT和p-mTOR，结果发现，与siNC组相比，转染siIL-32#1和siIL-32#2组胃癌细胞的p-mTOR、p-AKT、p110α、p85α表达水平明显降低。上述结果表明IL-32抑制胃癌细胞发生自噬，可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

综上，IL-32抑制胃癌细胞发生自噬，其机制可能与激活PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。然而IL-32调控该信号通路的机制目前尚不明确，这是本课题组下一步要解决的重要问题。