循环肿瘤细胞与子宫颈癌临床病理的关系及临床意义

李荣岗，廖悦华，孙丽霞，黄秀芳，周 伟

子宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，近年来呈年轻化趋势，且中晚期子宫颈癌患者的复发及转移率高、预后差[1-2]。因此，如何监测子宫颈癌患者复发/转移风险、评估疗效成为子宫颈癌治疗中的重点和难点。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)是指在肿瘤形成或进展过程中从原发灶或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞，能够真实反映肿瘤负荷，具有发展为转移病变的潜力。CTC在1869年由Ashworth[3]首次发现，近十几年来得到广泛研究。目前，FDA唯一批准的用于监测肿瘤的临床数据均为基于CellSearch获得，且限用于乳腺癌[4]、结直肠癌和前列腺癌，而对于CTC检测技术在子宫颈癌中应用的研究甚少。本实验利用基于亲和性的免疫磁珠阴性富集方法联合免疫荧光原位杂交技术(immunofluorescence in situ hybridization, imFISH)技术，通过回顾性分析健康女性志愿者和子宫颈癌患者外周血CTC，探讨CTC与子宫颈癌临床病理特征的关系，并进一步探讨CTC检测技术在预测子宫颈癌复发/转移中的实用价值，从而为临床医师评估子宫颈癌患者预后提供更多可靠证据。

1 材料与方法

1.1 临床资料随机选取广东省江门市中心医院2016年1月～2017年12月经病理证实的80例子宫颈癌手术标本作为实验组纳入研究，其中鳞状细胞癌70例、腺癌10例。患者年龄36～71岁，中位年龄53岁。根据国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)2018版[5]子宫颈癌分期系统重新进行分期。由于临床上对早期(ⅠA～ⅡA期)和进展期(ⅡB～Ⅳ期)子宫颈癌的治疗方式不同，因此本研究将实验组划为早期组和进展组，分别为18例和62例。其余临床信息经电子病历查询获得。因子宫颈癌患者2年内复发/转移比例较高，故本实验随访结束时间为确诊后24个月，随访结束时实验组复发/转移病例47例。另收集47例同期女性健康志愿者为对照组，年龄31～67岁，中位年龄50岁。本实验获得医院伦理委员会通过，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1CTC检测 本实验采用基于亲和性的免疫磁珠阴性富集联合imFISH检测受试者外周血CTC。荧光原位杂交样品处理试剂盒购自江苏莱尔公司，所有操作规程及判读标准按照试剂盒说明书进行。受试者外周血采集应用真空采血管采集肘正中静脉血，为防止穿刺过程中上皮细胞污染，弃用前2 mL血，采集此后的4 mL静脉血置于ACD抗凝管中。采集的血液样本12 h内去除血浆，裂解液去除红细胞，磁珠孵育混匀去除白细胞，分离液分离富集肿瘤细胞。使用CD45抗体进行细胞免疫荧光检测，8号着丝粒探针进行荧光原位杂交。使用奥林巴斯BX63荧光显微镜全自动扫描阅片，并进行人工复核。判读标准：二倍体信号或CD45阳性为淋巴细胞(图1A、B)，≥三倍体且CD45阴性为肿瘤细胞(图1C、D)。根据试剂盒说明书，以CTC计数≥2个/4 mL定义为CTC阳性(图1)。根据随访时间，CTC检测时间节点为术后3、6、12和18个月，若病理组织学和标准影像学确诊患者发生复发/转移则停止检测。

图1 淋巴细胞和肿瘤细胞在荧光显微镜下的显色模式：A.为淋巴细胞二倍体；B.为淋巴细胞CD45阳性；C.肿瘤细胞8号着丝粒探针三倍体；D.肿瘤细胞8号着丝粒探针四倍体

1.2.2病理判读 所有病理结果均由两位高级病理医师重新复核，对怀疑淋巴脉管侵犯的病例加做免疫组化CD31(EP78，即用型)和Podoplanin(D2-40，即用型)证实，两种抗体均购自北京中杉金桥公司，免疫组化染色采用Roche BENCHMARK-XT全自动免疫组化仪，应用EnVision两步法染色。以病理组织学活检和标准影像学作为判断子宫颈癌复发/转移的金标准。

1.3 统计学方法应用SPSS 20.0软件包进行统计学分析及受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)分析。各组资料的比较采用χ2检验和Fisher精确概率检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫颈癌患者外周血CTC与临床病理特征的关系对实验组受检者一般临床病理资料进行分析，结果显示不同年龄、是否绝经、病理组织学类型组间外周血CTC差异无统计学意义(P>0.05，表1)；而发生淋巴结侵犯和未发生淋巴结侵犯的CTC阳性率分别为94.87%(37/39)和36.59%(15/41)，发生淋巴脉管侵犯和未发生淋巴脉管侵犯的CTC阳性率分别为81.48%(44/54)和30.77%(8/26)，FIGO分期Ⅰ～ⅡA和ⅡB～Ⅳ的CTC阳性率分别为44.44%(8/18)和70.96%(44/62)，提示发生淋巴结侵犯和脉管侵犯及临床分期越高的患者，CTC阳性率越高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 子宫颈癌患者外周血CTC与临床病理特征的关系[n(%)]

2.2 对照组与实验组及实验组有无复发/转移患者外周血CTC的差异对照组外周血CTC阳性率为4.26%(2/47)，2例阳性患者经人HPV检测、阴道镜及腹部超声检查，并行子宫颈活检，诊断为子宫颈慢性炎及子宫肌瘤，未发现子宫颈恶性病变；实验组外周血CTC阳性率为65.0%(52/80)，两组比较差异具有统计学意义(χ2=53.073，P<0.05)。实验组有复发/转移和无复发/转移患者的外周血CTC阳性率分别为93.62%(44/47)、24.24%(8/33)，差异具有统计学意义(χ2=38.022，P<0.001)。通过ROC分析其曲线下面积达0.803，说明具有良好的特异性(P<0.001，图2)。

图2 健康志愿者和子宫颈癌患者CTC检测的ROC分析

3 讨论

2018年WHO统计结果显示，全球子宫颈癌每年新发病例近57万，死亡病例约31.1万例，其中我国每年新发子宫颈癌病例10.6万，死亡病例约4.8万例。子宫颈癌的5年总生存率约50%，经系统治疗后仍有75%患者在2年内复发。恶性肿瘤的复发/转移是影响患者预后的重要因素。近来，CTC被认为是肿瘤转移的重要因素之一，目前主要用于肿瘤复发/转移的风险评估[6-9]。新进研究[10]提示，CTC有望作为药效动力学和预测性的生物标志物，为临床治疗决策提供实质性的帮助，并有望在精准医学快速发展的今天，成为肿瘤的伴随诊断标志物，从而有效的筛选出最有可能受益的患者。

CTC是进入到外周血中的肿瘤细胞，被认为是肿瘤转移过程的关键环节。然而，血液中的CTC极为稀少，如何有效捕获、分离和收集CTC极具挑战性。在现有的各种CTC技术中，基于亲和性的CTC捕获分离技术使用最为广泛。该技术利用CD45磁珠抗体吸附白细胞，在磁场的作用下对其进行去除，可以富集具有全部特征的CTC，包括上皮细胞黏附分子(EpCAM)、CK阴性、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)特征的CTC。

有研究[11]显示，在子宫颈上皮内瘤变和早期子宫颈浸润癌中，随着病变程度的加重，基于亲和性的免疫磁珠阴性富集的方法CTC的阳性率及数量均增加。目前，国内外关于检测CTC在肺癌和乳腺癌中的研究较多，其在评估子宫颈癌预后价值方面也有文献报道。Wen等[12]报道显示，局部晚期子宫颈癌患者行放疗后，CTC阳性患者的无瘤生存期较短、预后差，进一步分析提示CTC是子宫颈癌患者2年无瘤生存期的独立预后因素。本实验同样基于亲和性的免疫磁珠阴性富集检测方法，结果显示子宫颈癌复发/转移患者的CTC阳性率明显高于无复发/转移者，提示CTC检测技术可以有效预测子宫颈癌复发/转移。此外，本实验结果显示CTC在判断子宫颈转移癌中具有较高的敏感性和特异性，与金标准具有较高的一致性。同时还发现，CTC与淋巴结侵犯、淋巴脉管侵犯和FIGO分期明显相关，而与患者年龄、是否绝经及组织学类型无关，提示CTC水平与肿瘤恶性程度相关，与Wen等[12]研究结果一致。但Wen等的报道中CTC与FIGO分期无相关性，与本研究不一致，可能与Wen等收集病例均为晚期子宫颈癌患者有关。本实验组中5例死亡患者的CTC检测结果均为阳性，提示CTC检测可以作为评估子宫颈癌转移的预后指标。

综上，CTC检测技术在评估子宫颈癌复发/转移中具有较高的敏感性和特异性，且CTC水平与淋巴结侵犯、淋巴脉管侵犯和FIGO分期相关，可以反映子宫颈癌的恶性程度，可作为预测子宫颈癌复发/转移的重要指标之一。CTC检测技术作为液体活检的重要组成部分，具有微创性甚至无创性、操作简单、检测报告周期短等优势，具有可普及性。