携带BRCA基因致病性变异的胆道癌3例临床病理及分子遗传学特征

顾怡瑾，李安琪，董 磊，谢嘉玲，袁 菲，王朝夫

胆道癌(biliary tract cancer, BTC)是一组具有高度异质性的恶性上皮性肿瘤[1]。对常规放、化疗不敏感，中位总生存期(median overall survival, mOS)约12个月[2]。随着高通量测序技术的发展，揭示了胆道癌的高频基因变异如TP53、KRAS和SMAD4等在疾病发病机制中的关键作用[3]。国外研究发现，有3.6%的BTC可检测到乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene, BRCA)变异[4]，但国内尚缺乏相关报道。本实验室在开展胆道癌高通量测序研究中发现3例携带BRCA基因致病性变异的胆道癌(BRCA-mutant biliary tract cancers, BRCA-mutant BTC)，探讨其临床病理及分子病理学特征，有助于认识其在临床治疗上的价值。

1 材料与方法

1.1 材料收集2019年5月～2022年1月上海交通大学医学院附属瑞金医院病理科经高通量测序检测的BTC 19例，经生物信息分析筛选出3例BRCA-mutant BTC，并对患者进行随访，末次随访时间2022年5月19日。

1.2 方法

1.2.1高通量测序检测 采用QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒提取3例样本肿瘤组织的石蜡基因组DNA，使用燃石生物公司OncoScreen Plus Panel检测试剂盒制备文库。通过NextSeq4 000(Illumina)平台对基因组DNA文库进行测序。

1.2.2基因组变异的生物信息分析解读 根据国内外相关指南及共识[5-6]，对3例BTC进行Ⅰ类(有较强临床重要性的变异)和Ⅱ类(有潜在临床重要性的变异)解读。

1.2.3Sanger测序验证 采用QIAGEN QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取2例样本的外周血基因组DNA，并针对检测到的BRCA基因致病变异位点分别进行引物序列设计[7]，以相应DNA为模板进行PCR扩增及测序。测序结果与基因库BRCA基因参考序列比对。

2 结果

2.1 临床病理特征19例BTC行高通量测序并经生物信息分析解读，检出3例BRCA基因致病性变异，确诊为BRCA-mutant BTC。3例BRCA-mutant BTC中，例1、2为手术切除标本，例1肿瘤位于胆囊底部，例2肿瘤侵及胆管壁及部分胆囊壁，切面均灰白色，质中；例3肿瘤位于肝门部胆管，送检为穿刺组织。3例组织学类型均为腺癌，例1(图1)及例2组织学分级均为中分化，例2伴胆管旁及胆囊周围淋巴结转移。相关临床病理、治疗及随访预后情况详见表1。家庭史：例1患者姐姐和例2患者父亲患有胰腺癌。

表1 3例BRCA-mutant BTC的临床病理特征及随访

图1 例1肿瘤组织HE染色：腺癌，中分化，细胞核增大，核仁突出，核分裂象增多

2.2 分子病理特征3例BRCA-mutant BTC分别检出1例BRCA1和2例BRCA2基因致病性变异，均为截断突变，例1及例2的肿瘤组织及外周血样本经Sanger测序验证，均为胚系变异(图2)。同时，均检出TP53基因不同位点的Ⅱ类变异。另例2还携带ARID1A、CDKN2A、FBXW7基因变异，例3携带PDGFRA基因拷贝数扩增。肿瘤变异负荷(tumor mutation burden, TMB)值为5.98～12.96 Mut/Mb，均为肿瘤微卫星稳定(microsatellite stable, MSS)(表2)。

表2 3例BRCA-mutant BTC的高通量测序

图2 A.例1肿瘤组织测序BRCA2基因c.2095C>T导致p.Gln699*；B.例1外周血样本测序基因变异同肿瘤组织

2.3 随访例1患者行化疗，随访8个月，健在；例2患者行免疫治疗联合靶向治疗，随访34个月，因BTC伴肝腹水死亡；例3患者行化疗，随访37个月，因肝衰竭及BTC伴多部位淋巴结转移死亡。

3 讨论

BRCA基因的致病性变异与乳腺癌、卵巢癌等肿瘤的发生密切相关，同时还是PARP抑制剂治疗相关的生物学标志物[8]。Golan等[9]在研究胆管癌临床特征时发现携带BRCA2基因致病变异的人群患BTC的风险增加，Hirosawa等[10]提出BRCA-1相关蛋白(BAP1)缺失会导致细胞侵袭。因此，BRCA-mutant BTC是BTC的特殊分子亚型。目前，PARP抑制剂已运用于携带BRCA基因变异的转移性胰腺癌患者，延长其无进展生存期，疗效获得肯定[11]。然而，其能否运用于BTC中值得探究。

本组对19例BTC进行高通量测序发现3例BRCA-mutant BTC。由于样本量较小，国内尚未见报道，故本文针对这一分子亚型进行国外文献复习(表3)。国外研究者已在BTC中发现此分子亚型的胚系及体系变异，并已提出BRCA基因变异会影响BTC的DNA损伤修复[12]，与BTC易感性相关[13]，PARP抑制剂可能使此类患者得到更多的治疗选择。

表3 BRCA-mutant BTC国外文献汇总

本组对3例BRCA-mutant BTC进行总结，例2和例3患者均已为中晚期。临床对3例患者分别进行了不同的治疗方式，例2和例3分别采用靶向治疗联合免疫治疗和化疗，两者的总生存期差异不明显(34个月和37个月)。因此对于中晚期BTC患者，建议尽早进行高通量测序，寻找有效靶向基因。

BRCA-mutant BTC的胚系变异与体细胞变异有不同的侧重点。胚系变异侧重于遗传疾病的致病性，会显著增加BRCA基因相关肿瘤的发病风险；体细胞变异侧重于对靶向药物敏感性的判断[5]。因此，明确BRCA-mutant BTC患者胚系或体细胞变异的临床及分子遗传学特征非常重要，在检测出肿瘤BRCA致病性变异后，应对患者的外周血或咽拭子样本进行采样，以进行更好的胚系遗传评估。本文对例1和例2的肿瘤及外周血样本进行Sanger测序验证，均检出BRCA基因变异，证实2例均为胚系变异。结合这2例患者均有一级亲属患胰腺癌的家族遗传史，而胰腺癌患者的BRCA基因变异率为0～17%[14]。因此，具有BRCA基因胚系变异BTC患者，提示直系亲属患BRCA基因相关肿瘤的发病风险会增高，应对其直系亲属进行遗传咨询及筛查，告知上述风险使其能提早预防。

本组3例BRCA-mutant BTC患者均检出TP53基因变异，并提示了微卫星状态和TMB值。Valle等[15]发现BTC的TP53变异率为40%～59%，患者总生存期时间短，提示其变异是肿瘤发生及患者生存的高风险因素。Goeppert等[16]发现只有1.3%的BTC患者为高频微卫星不稳定。TMB阈值目前在BTC的不同研究中均有差异[17-18]。因此，本组3例BRCA-mutant BTC微卫星状态及TMB值尚不足以为临床治疗提供依据。

综上所述，采用高通量测序技术检测到BRCA-mutant BTC这一少见的BTC分子亚型，提示对于中晚期BTC患者基因检测可以为临床治疗提供新方向。同时，区分胚系或体细胞BRCA基因变异对BRCA-mutant BTC尤为重要。