非小细胞肺癌中EGFR、ALK、ROS1基因突变和PD-L1表达及临床意义

伍锦凤，何 杰

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均位居所有恶性肿瘤之首[1-2]，其中NSCLC占肺癌的80%～85%[3]。近年随着肿瘤驱动基因和免疫靶点的深入研究，肿瘤靶向治疗及免疫治疗已广泛应用于临床，它们具有特异性高、不良反应轻等特征，其中EGFR、ALK、ROS1作为肺癌的驱动基因是靶向治疗的重要靶点，EGFR基因突变状态可以指导EGFR-TKI的治疗[4]；ALK及ROS1基因融合状态可以指导ALK/ROS1抑制剂的治疗[5]；PD-L1是免疫治疗重要的预测标志物，目前已有多项研究证实，在恶性肿瘤的治疗中阻断PD-1/PD-L1通路的免疫治疗疗效显著[6]，PD-L1阳性NSCLC患者对PD-1单抗(PD-L1抑制剂)有更高的总体缓解率，这些靶向药物及免疫治疗的药物也相继被CFDA批准进入医保，减轻了患者负担。本文对84例NSCLC分别行EGFR、ALK、ROS1、PD-L1检测，分析EGFR/ALK/ROS1基因突变状态和PD-L1蛋白表达及与临床病理特征的关系，并探讨在NSCLC靶向治疗及预后评估中的临床价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集安徽省肿瘤医院2018年1月～2019年12月存档的84例NSCLC手术标本，其中男性54例，女性30例，年龄36～83岁，中位年龄66岁，吸烟者39例，非吸烟者45例，患者术前均未接受其他治疗。所有病例切片均由2位高年资病理医师重新复诊，最终确诊腺癌71例，鳞状细胞癌13例。

1.2 方法

1.2.1突变扩增阻止系统(amplification refractory mutation system, AMRS) EGFR基因突变检测试剂盒(包含18、19、20、21外显子29个位点突变，武汉友芝友生物公司)配制试剂，提取DNA，DNA稀释浓度为10～15 ng/μL，逆转录，ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，主要程序：37 ℃ 10 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，40个循环；60 ℃ 60 s(采集荧光)40个循环。反应结束后计算ΔCt值并进行结果判读。所有试验均设阴、阳性对照。

1.2.2FISH 标本4～5 μm厚切片，65 ℃烤箱内过夜，置于全自动FISH前处理系统仪(武汉康录生物公司)中，进行脱蜡、酶解消化；滴加ALK及ROS1基因融合检测荧光原位杂交探针(武汉康录生物公司)，置入Hydridizer原位杂交仪(丹麦，DAKO公司)中杂交2 h，复染DAPI后置于OLYMPAS BX53荧光显微镜下观察。

1.2.3二代测序(next generation sequencing, NGS) 石蜡组织DNA提取试剂盒(磁珠法)(华大基因)提取石蜡样本的基因组DNA，DNA浓度>5 ng/μL，采用EGFR-KRAS-ALK基因突变联合检测试剂盒(华大基因)构建DNA测序文库，并采用特定的探针捕获目标DNA片段，BGI MGISEQ 2000测序平台(华大基因)进行测序，读长为PE100，测序深度>500×，将得到的原始数据进行过滤并行生物信息学分析。

1.2.4免疫组化 组织标本4 μm厚切片，在Autostainer link 48免疫组化仪中预热的低pH抗原修复液97 ℃孵育20 min，一抗PD-L1(22C3)室温孵育30 min，小鼠LINKER室温孵育30 min，HRP室温孵育30 min，DAB显色及增强后苏木精复染，显微镜下观察。所有试验均设阴、阳性对照。PD-L1结果判读依据TPS诊断标准：肿瘤比例评分是指部分或完整膜染色的肿瘤细胞占样本中所有活肿瘤细胞的百分比，TPS=染色阳性肿瘤细胞数/总活肿瘤细胞数×100%，TPS<1%为不表达，TPS 1%～49%为低表达，TPS≥50%为高表达。

1.3 统计学分析采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，应用χ2检验列联表对数据进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC中EGFR、ALK及ROS1基因突变与临床病理特征的相关性84例NSCLC中，45例EGFR突变，突变率为53.6%，突变类型：19Del占33.3%，21L858R占46.7%，21L861Q占4.44%，20ins占6.67%，其余类型占8.89%，包括19Del与20T790M、20T790M和21L858R、18G719和19Del、18G719和21L858R双突变各1例。敏感突变占88.9%，包括19Del、21L858R、21L861Q和18G719；原发耐药突变占11.1%，包括20T790M和20ins(图1)。EGFR突变与患者性别、年龄、是否吸烟、肿瘤病理类型以及肿瘤分化程度有关(P<0.05)，与淋巴结转移及临床分期无关(P>0.05，表1)。84例NSCLC中，2例ALK融合阳性，占2.38%；1例ROS1融合阳性，占1.19%；2例ALK重排阳性，均发生于高分化腺癌，1例ROS1重排阳性发生于中～低分化腺癌(图2)。EGFR突变和ALK或ROS1重排具有排他性，未见同时显现。

表1 EGFR突变、PD-L1蛋白表达与NSCLC临床病理特征的关系

图1 NSCLC中EGFR基因突变类型及突变率：EGFR基因突变类型为21L858R占46.7%，19Del占33.3%，21L861Q占4.44%，20ins占6.67%，其余类型占8.89%

图2 NSCLC中ALK、ROS1基因融合情况：A.可见红绿信号分开距离大于2个信号点的距离，示ALK阳性；B.可见红绿信号没有分离及未见单个红色信号，示ALK阴性；C.可见红绿信号分开大于2个信号点的距离及单个绿色信号点，示ROS1阳性；D.可见红绿信号没有分离及未见单个绿色信号，ROS1基因融合阴性

2.2 PD-L1蛋白表达与NSCLC临床病理特征的相关性84例NSCLC中，PD-L1不表达38例(45.2%)，低表达23例(27.4%)，高表达23例(27.4%)(图3)。PD-L1表达与肿瘤病理类型有关(P<0.05)，与患者性别、年龄、是否吸烟、肿瘤分化程度、淋巴结转移及临床分期均无关(P>0.05，表1)。

图3 NSCLC中PD-L1蛋白表达情况

2.3 NSCLC中PD-L1蛋白表达与EGFR、ALK、ROS1基因突变的相关性84例NSCLC中，EGFR突变45例，ALK重排2例，ROS1重排1例。分析PD-L1蛋白表达与三者之间的相关性，发现PD-L1蛋白表达与EGFR、ALK、ROS1基因突变情况均无关(P>0.05，表2)。

表2 PD-L1蛋白表达与EGFR、ALK、ROS1基因突变的相关性

3 讨论

EGFR常见的突变位点包括18、19、20及21外显子，EGFR-TKIs(如吉非替尼、厄洛替尼等)靶向药物有显著疗效，外显子20(T790M、INS)突变可引起TKIs的耐药[7]，L861Q、G719X、S768I等其它突变类型患者对EGFR-TKI的反应性低于19Del和L858R突变患者，突变率较低，且常常倾向于以联合突变的形式存在[8]，因此准确评估EGFR的突变状态尤为重要。本文两组经典突变19Del和21L858R突变占80.0%(36/45)，与以往研究结果一致；其它突变包括20T790M、21L861Q、20ins和18G719仅占20%(9/45)，其中耐药突变占11.1%(5/45)，包括20T790M和20ins。进一步分析EGFR基因与临床病理特征的相关性发现，女性患者的突变率高于男性患者，年龄<60岁患者的突变率较高，非吸烟患者的突变率较高，病理类型为腺癌的突变率高，高分化肿瘤的突变率比中、低分化肿瘤的突变率高。探讨基因突变与临床病理特征的关系可以评估突变状态，筛选适合基因检测的患者。本组结果显示：年轻、不吸烟的女性高分化腺癌患者的总体突变率较高，应作为基因检测及靶向治疗的重点筛查对象。

ALK和ROS1基因融合是除EGFR外两个明确的NSCLC驱动基因，ALK和ROS1基因融合患者使用克唑替尼、阿来替尼等靶向药物可取得较好的疗效。NCCN指南建议对腺癌、大细胞癌和组织学无法确定类型的NSCLC以及非吸烟、活检小标本或混合组织学类型的鳞状细胞癌患者同时进行EGFR/ALK/ROS1基因检测[9]。ALK是一种Ⅰ型膜糖蛋白，被认为是肺癌的主要致瘤驱动基因之一，ALK基因融合多见于年轻、非吸烟的NSCLC患者[10]，本组84例患者中检测到2例ALK基因融合(2.38%)。在全球范围内NSCLC中ROS1基因融合的发病率为1%～2%[11]，东亚人口的发病率略高，为2%～3%[12]，本组84例NSCLC中发现1例ROS1融合阳性，阳性率为1.19%，这与既往文献报道较一致。另外本实验发现，EGFR/ALK/ROS1基因突变具有排他性，未见三者突变的同时显现，这与既往研究亦较一致。

PD-1是免疫球蛋白超家族1型跨膜糖蛋白，主要表达于活化的T细胞表面，其配体PD-L1广泛表达于T细胞、B细胞、单核细胞及多种肿瘤细胞[13]，PD-1和PD-L1结合可导致淋巴细胞凋亡，此种免疫负调节致使肿瘤细胞免疫逃逸，最终导致肿瘤生长及扩散。免疫抑制剂能够阻断信号通路，降低免疫逃逸，加速肿瘤凋亡，从而达到消除肿瘤的目的。研究显示NSCLC中PD-L1的阳性率为39.9%～53.1%[14]，本组PD-L1不表达占45.2%，低表达占27.4%，高表达占27.4%。同时本实验发现PD-L1表达与肿瘤病理类型有关，鳞状细胞癌患者不表达及低表达率比腺癌患者高；PD-L1表达与患者性别、年龄、是否吸烟及肿瘤分化程度、有无淋巴结转移及临床分期均无关。有研究显示，NSCLC中EGFR野生型患者PD-L1的阳性率高于EGFR突变型患者[15]；另有研究显示，EGFR突变型患者的PD-L1阳性率比野生型高[16]。本文分析EGFR/ALK/ROS1基因突变与PD-L1表达的相关性，结果显示PD-L1蛋白表达与EGFR/ALK/ROS1突变均无关。目前，对于EGFR/ALK/ROS1基因突变状态与PD-L1蛋白表达相关性的研究结果较多，呈正相关、负相关及无相关性的均有报道，因此大样本多中心的研究尤为重要，四者联合检测可以为患者提供更加准确的治疗方案，真正得益于靶向及免疫治疗。