基于效应成分指数的丹参配伍应用研究*

刘振杰，谭小青，丘海芯，覃喜军，孙雪萍，高红伟

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530299；2.广西壮族自治区中医药研究院/广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530001；3.广西优势中成药与民族药开发工程技术研究中心，广西 南宁 530299）

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，味苦、性微寒，归心、肝经[1]，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效，用于胸痹心痛、脘腹胁痛、癥瘕积聚、热痹疼痛、心烦不眠、月经不调、痛经经闭、疮疡肿痛等[2]。丹参作为活血化瘀的要药，其活血功效已成为共识，常常配伍其他中药使用，但关于其配伍后有效成分含量的变化情况的研究较少，并且配伍后对其活血功效产生的影响仍然不明确[3-5]。因此，本实验在前期研究[6-9]基础上建立HPLC法同时测定丹参中9种成分含量，并计算效应成分指数（effectconstituent index,ECI）值，阐释配伍应用对丹参中活性成分的影响，以期为该药材质量控制提供基础，也为临床应用提供参考。

1 材 料

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪，配置2489紫外检测器（Waters公司）；JA2003型电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；调温型电热套（北京市永光医疗仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 丹参于2018年5月购于四川省成都市国际商贸城荷花池中药材专业市场，产地为四川中江，经广西中医药大学药学院孙雪萍副研究员鉴定为丹参正品。人参（批号：191107，桂林鼎康中药饮片公司）、黄芪（批号：191101，桂林鼎康中药饮片公司）、红花（批号：200101，化州市华逸中药学饮片有限公司中药饮片厂）、制何首乌（批号：191001，广西民生堂中药研制有限公司）、山药（批号：191101，桂林鼎康中药饮片公司）、当归身（批号：191201，桂林鼎康中药饮片公司）、盐牛膝（批号：191101，桂林鼎康中药饮片公司）、茯苓（批号：200302，化州市华逸中药学饮片有限公司中药饮片厂）、山楂（批号：200101，安徽三义堂中药饮片有限公司）、熟地黄（批号：191102，桂林鼎康中药饮片公司）、醋郁金（批号：20190901，南宁市景昌中药饮片有限公司）、生地黄（批号：191202，化州市华逸中药学饮片有限公司中药饮片厂）、三七（批号：191102，桂林鼎康中药饮片公司）、麦冬（批号：190702，安徽三义堂中药饮片有限公司）、赤芍（批号：191201，广西民生堂中药研制有限公司）、制川乌（批号：20200301，南宁市景昌中药饮片有限公司）、白芍（批号：200201，广西民生堂中药研制有限公司）、甘草（批号：200101，广西民生堂中药研制有限公司）、醋香附（批号：190801，桂林鼎康中药饮片公司）、葛根（批号：20191201，南宁市景昌中药饮片有限公司）、五味子（批号：20200201，南宁市景昌中药饮片有限公司），以上药材均购买于广西一心医药集团有限责任公司；丹参素钠对照品（批号：17122102）、原儿茶醛对照品（批号：17060708）、迷迭香酸对照品（批号：18030901）、丹酚酸B对照品（批号：18040201）、丹酚酸A对照品（批号：18030807）、二氢丹参酮Ⅰ对照品（批号：17120808）、丹参酮Ⅰ对照品（批号：17122704）、丹参酮ⅡA对照品（批号：17052605）、隐丹参酮对照品（批号：18032807），以上对照品皆购于成都普菲德生物科技有限公司，纯度均≥98%；色谱纯乙腈（美国Fisher Scientific有限公司）；色谱纯甲酸（赛默飞世尔科技中国有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Ultimate Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）梯度洗脱，梯度洗脱程序：0 min，10% A，20 min，28% A，35 min，48% A，40 min，60% A，60 min，100% A；体积流量为1 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长为270 nm；进样量为20 μL。色谱图见图1。

2.2 混合对照品溶液制备 精密称取丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品适量，用甲醇制成以上各成分质量浓度分别为0.230、0.250、0.210、0.200、0.200、0.031、0.029、0.031、0.037 mg/mL的混合对照品贮备液，经0.22 μm微孔滤膜过滤。

2.3 供试品溶液制备 将丹参切制成规格相近的饮片，取300 g备用。随机称取10.0 g置于500 mL的圆底烧瓶中，加入10倍量的水，先行浸泡30 min，再使用调温型电热套进行加热回流，总时长为2 h，加热结束后过滤，将滤液定容至100 mL储存在4 ℃冰箱内，为后续实验做准备。精密量取提取液1 mL，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，摇匀。

随机称取丹参10.0g和某一中药10.0g，两者置于圆底烧瓶，加入10倍量的水，同“2.3”的制备方法一致。丹参单煎液、丹参与当归等21味中药分别合煎的样品，见表1。

表1 丹参与21 种药材配伍应用的样品表

2.4 线性关系考察 将“2.2”项下混合对照品贮备液用甲醇依次稀释成不同浓度的混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样20 μL测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，分别以S/N=3、S/N=10为检测限、定量限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液20 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA峰面积的RSD值分别为1.58%、1.47%、1.70%、1.71%、1.71%、1.11%、1.60%、2.83%、0.71%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取丹参-当归样品（编号为S2），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、10、12、24 h在“2.1”项色谱条件下各进样20 μL测定，测得丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA峰面积的RSD值分别为1.26%、0.99%、0.91%、1.23%、0.26%、2.14%、1.02%、2.01%、2.00%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一批次丹参饮片6份，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样20 μL测定，测得丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA峰面积的RSD值分别为1.46%、0.89%、1.91%、1.43%、0.86%、2.10%、1.08%、2.32%、1.70%，表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取各成分含有量已知的丹参提取液6份，分别以100%水平加入对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，平均加样回收率分别为99.94%、98.47%、98.80%、98.23%、96.42%、100.06%、98.26%、98.87%、100.05%。RSD值分别为2.58%、1.54%、1.57%、0.96%、0.74%、3.30%、1.27%、0.64%、1.49%，表明方法准确度良好。

2.9 样品含量测定 取所制备的22份提取液样品，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量。结果表明，22批提取液样品中9个成分的含量存在一定的差异，丹参配伍郁金、茯苓、川芎、熟地黄、何首乌，特别是配伍三七和红花后，配伍提取液中的丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸、丹参酮ⅡA等成分的含量明显增多。（见表4）2.10 聚类分析和热图分析 用MetaboAnalyst 5.0软件将含量测定结果进行聚类分析和热图分析，结果见图2。由聚类分析结果可知，丹参配伍郁金、茯苓、川芎、熟地黄、何首乌聚为第一类；丹参配伍三七和红花聚在一起，然后与香附和人参共聚为第二类；丹参配伍山药、甘草、黄芪聚在一起，与丹参配伍五味子、山楂、葛根共聚为第三类；丹参配伍牛膝、白芍、麦冬、当归、赤芍、生地黄聚为第四类；丹参单独为第五类。由热图结果可知，方格中的红色越深代表该成分的含量越高，而蓝色越深代表该成分的含量越低，丹参配伍后各成分的含量均有一定程度的升高，丹参配伍郁金、川芎、熟地黄、香附、三七等可以提高丹酚酸B的含量；丹参配伍人参、红花、山楂等可以提高隐丹参酮的含量；丹参除了配伍麦冬、当归、赤芍和生地黄外，配伍其他味药材均可以提高丹参酮ⅡA的含量。2.11 丹参活血生物效价的计算 将体质量240～260 g的雄性SD大鼠腹腔注射0.12 mol/L戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻醉，以0.13 mol/L枸橼酸纳1∶9抗凝腹主动脉取血。100 g离心15 min，吸取上液作为富血小板血浆（PRP），剩余部分以2 000 g离心10 min，取上清液即为贫血小板血浆（PPP），以PPP调节PRP的血小板浓度至所需浓度。取PRP 175 μL加入测试杯，进行仪器调零；然后取PPP 50 μL加入测试杯37 ℃温育，再加入25 μL花生四烯酸，记录血小板聚集曲线。

表4 各成分含有量测定结果（mg/g，n=6）

取PRP 175 μL加入测试杯，进行仪器调零；然后分别取50 μL不同浓度的单体化合物溶液（丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮IIA、丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮）或者丹参提取物供试品加入测试杯37 ℃温育，再加入25 μL花生四烯酸，记录血小板聚集曲线。根据公式计算基于血小板最大聚集的抑制率，计算公式：最大抑制率=[（空白血浆最大聚集率-供试品最大聚集率）/空白血浆最大聚集率]×100%。

选取隐丹参酮为标准对照物质，定义隐丹参酮效价为1 000 U/mg。应用解放军总医院第五医学中心开发的《中药生物效价计算软件》计算各单体化合物和丹参药材的相对效价。2.12 ECI的计算 丹参ECI公式由肖小河等[7]前期构建，根据不同单体成分的抗血小板聚集率，计算的单体化合物的相对生物效价。丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I、二氢丹参酮I的相对生物效价（U/mg）分别为4.995、4.782、9.869、18.920、13.290、1 000、0、0、0。以所有组成成分的相对生物效价为Fi，代入公式中计算ECI，结果见表5。丹参ECI的公式如下：

表5 22 份样品的ECI

公式中Fi为各单体化合物的生物效价；公式中Ci为丹参药材中各单体化合物的含量；公式中n为选择的丹参药材中单体化合物的数目；公式中i是变数，表示对i求和。将生物效价代入公式即得：丹参样品的ECI=（4.995×丹参素钠含量）+（4.782×原儿茶醛含量）+（9.869×迷迭香酸含量）+（18.920×丹酚酸B含量）+（13.290×丹酚酸A含量）+（1 000×隐丹参酮含量）+（0×二氢丹参酮I含量）+（0×丹参酮I含量）+（0×丹参酮IIA含量）。

结果显示，22批提取液样品中9个成分的含量存在一定的差异，丹参与香附、郁金、何首乌、熟地黄、茯苓、三七、川芎等配伍煎煮后的提取液的ECI值较高。

3 讨 论

本研究考察了流动相甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸等洗脱方式，发现与甲醇相比，乙腈洗脱能力、分离效果较好，最终确定为乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱。丹参酮类成分紫外光谱在270 nm波长有最大吸收，丹酚酸类成分在280 nm有最大吸收，实验发现在270 nm条件下，9个色谱峰峰形良好，分离度理想，故选择270 nm作为检测波长。

ECI是基于化学成分分析和效应检测共同加权的质量评价指标，其可通过中药中活性成分的“量-效”关系方程来建立。由于中药含有多种化学成分，具有整体性特点，是通过多成分、多靶点协调起效而发挥药效作用，而测定单一或几个成分含量不能真正反映药材的与临床疗效关联的中药的质量。以指标性成分含量测定为代表的化学评价能够表征部分成分的定性定量差异，但这些检测指标与临床安全性和有效性关联性需要确认，未来中药的品质评控模式应是化学评价与生物评价相结合。因此，近年来，国内外课题研究组以黄连[6]、丹参[7]、附子[8]等为代表，探索建立了中药品质综合量化评价方法-ECI，本课题是在已经构建的丹参的ECI的基础上，应用其对丹参的配伍应用进行研究。

本研究通过查阅收集2020年版《中华人民共和国药典》收录的163种含丹参的成方制剂和从一些中成药网站收集到117种含丹参且在市面上销售的中成药作为资料来源，并统计与丹参配伍的中药及其出现频数，累计出现频数由高到低的前20味中药[10-15]。综合两者，最终选取频数较高的黄芪、当归、川芎、地黄、红花、茯苓、甘草、人参、赤芍、五味子、香附、三七、白芍、山药、山楂、郁金、牛膝、麦冬、葛根、何首乌20味药为研究对象（地黄又分生地黄、熟地黄）。

本研究中所选取与丹参配伍频率较高的20味药材中，活血化瘀功效较显著的中药有川芎、红花、当归、三七、赤芍，研究结果发现它们与丹参配伍后丹参素钠等9个有效成分的含量增加，对应计算出的ECI值升高，因此，与丹参合理配伍使用，能使丹参活血功效增强[16-17]。川芎、三七、郁金、红花、赤芍、山楂等为活血化瘀类中药，当归、何首乌、地黄等为补血药，五味子、牛膝、茯苓、麦冬、葛根等具有收涩、清热、利尿通淋等作用，这些中药与丹参相须或相使为用，配伍后起到减毒增效的作用。配伍后，对指标成分含量变化与配伍药材之间的相关性进行分析，可知，丹参配伍郁金、茯苓、川芎、熟地黄、何首乌，特别是配伍三七和红花后，配伍提取液中的丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸、丹参酮ⅡA等成分的含量明显增多，说明配伍可能对活性成分起到了增溶作用，从而增强了丹参的药效。另外，麦冬、当归、生地黄、黄芪等中药与丹参配伍后，丹酚酸B或丹参酮ⅡA等成分没有明显变化，所以其并不是通过增加丹参有效成分的溶出度来起效，也可能是通过自身的活血的活性成分来增强药效，或者是起到减少丹参副作用的功能。

2020年版《中华人民共和国药典》中规定，丹参药材饮片的含量测定项的指标性成分是丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA；丹参水提物（丹参总酚酸提取物）的指标性成分有原儿茶醛和迷迭香酸和丹酚酸B；而丹参酮提取物的特征图谱的共有峰又包括15,16-二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA；而复方丹参滴丸、丹参片、复方丹参片等含有丹参的中成药的含量测定方法也常选用以上的化合物为指标性成分，而且，这些成分也往往是丹参药材饮片及其制剂中含量较高的成分[1]。因此，笔者选用丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA作为含量测定的指标。根据相关文献报道，丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA具有抗血小板聚集、体外抗凝血的作用，这些成分作为含量测定指标与这些效应有直接相关性，也与丹参的活血化瘀功效有密切的关系[18-20]。