血清HBV pgRNA在核苷类似物治疗CHB患者中的临床价值*

于彤波,付 伦,赵汉东,王 嘉,刘红莉

西安市第八医院:1.检验科;2.肝病六科,陕西西安 710000;3.西安市人民医院/西安市第四医院检验科,陕西西安 710004

慢性乙型肝炎(CHB)是临床常见的传染性疾病，随病情加重，可进展为肝硬化及肝细胞癌等[1]。目前主要治疗药物有干扰素类及核苷类似物两种，核苷类似物以其用药方便、治疗疗效明显被临床广泛用于CHB患者的抗病毒治疗[2]。CHB是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起，故针对病因进行治疗在理论上可实现有限疗程。已有多项研究均指出无肝硬化的CHB患者停药标准，然而在临床中发现在停药后，部分患者可出现HBV DNA的突破[3]。共价闭合环状DNA的完全衰退可作为HBV清除的标志，接近CHB的治愈状态，然而核苷类似物不能直接作用于共价闭合环状DNA[4]。目前临床尚缺乏有效的标志物用于预测核苷类似物治疗CHB的效果[5]。血清HBV前基因组RNA(HBV pgRNA)是以HBV共价闭合环DNA为模板合成的基因。相关研究报道恩替卡韦在治疗CHB患者时，其血清HBV pgRNA水平可作为反映HBV共价闭合环状DNA转录活性的指标，推测HBV pgRNA可用于评估抗病毒治疗效果[6-7]。因此本研究探讨血清HBV pgRNA在核苷类似物治疗CHB患者中的临床价值，以期为临床治疗CHB提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2021年1月西安市第八医院收治的167例CHB患者为研究对象。入组患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]中的诊断标准。研究对象中男性106例，女性61例；年龄23～60岁，平均(41.61±4.59)岁；体重指数18.83～27.05 kg/m2，平均(22.96±3.25)kg/m2。纳入标准：(1)确诊为CHB且为初治患者；(2)入组前未接受抗乙肝病毒或核苷类似物等治疗。排除标准：(1)其他类型肝炎；(2)合并自身免疫系统疾病；(3)合并恶性肿瘤；(4)患有严重心、脑、肺等器官功能障碍；(5)神志异常不能配合治疗；(5)妊娠期或哺乳期妇女。本研究经西安市第八医院医学伦理委员会批准，且研究对象同意参加本项研究，并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1资料收集及血生化、T淋巴细胞亚群检测 收集研究对象年龄、性别、体重指数及CHB治疗药物(替比夫定、替诺福韦、恩替卡韦)等资料。采集研究对象清晨空腹静脉血5 mL，离心分离上层血清，采用全自动生化分析仪检测总胆红素(TBIL)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、 丙氨酸氨基转移酶(ALT)。利用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+)，计算CD4+/CD8+。

1.2.2HBV pgRNA检测 采集患者清晨空腹外周静脉血5 mL，3 000 r/min离心15 min，分离上清液置于-80 ℃冰箱保存。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测血清HBV pgRNA。取250 μL血清，用磁珠法提取HBV RNA，测定RNA浓度。采用荧光定量PCR仪(ABI Prism 7000型)进行反转录及扩增。RNAs反转录为cDNA，HBV RNA序列及内参序列见表1。反应体系20 μL，2×SYBP Mix 10 μL，10×cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃10 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 2 min，38个循环，72 ℃延伸10 min，以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt计算血清HNV pgRNA相对表达量。

表1 引物及内参序列

1.2.3治疗方法及效果评价 所有CHB患者均持续接受核苷类似物治疗12个月。完全应答：血清HBV DNA转阴、ALT正常；不完全应答：血清HBV RNA转阴或ALT正常。将完全应答及不完全应答定义为应答，反则为不应答。

2 结 果

2.1抗病毒治疗效果 167例CHB患者持续接受12个月的核苷类似物治疗后，42例(25.15%)CHB患者不应答，125例(74.85%)CHB患者获得应答。

2.2CHB应答与不应答患者临床资料 CHB获得应答患者性别、年龄、体重指数、治疗药物、TBIL、CD4+、CD8+、AST、ALT与CHB获得不应答患者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。CHB获得不应答患者乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阳性占比、HBV DNA载量、HBV pgRNA水平高于CHB获得应答患者，而CD4+/CD8+水平低于CHB获得应答患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 CHB获得应答与不应答患者临床资料比较

2.3影响核苷类似物治疗效果的多因素分析 将HBeAg状态(阴性=0，阳性=1)、HBV DNA载量、HBV pgRNA、CD4+/CD8+作为自变量，将治疗效果(应答=0，不应答=1)作为因变量纳入多因素Logistic回归分析，结果显示HBeAg状态(OR=3.849)、HBV DNA载量(OR=2.789)、HBV pgRNA(OR=4.016)为核苷类似物治疗CHB效果的影响因素(P<0.05)。见表3。

表3 多因素Logistic回归分析核苷类似物治疗CHB效果的影响因素

2.4血清HBV pgRNA预测核苷类似物治疗效果的价值 ROC曲线分析显示血清HBV pgRNA预测核苷类似物治疗CHB效果的AUC、灵敏度、特异度、约登指数及最佳截断点分别为0.855(95%CI：0.792～0.905)、64.29%、95.20%、0.595、5.54 lg copy/mL。见图1。

3 讨 论

HBV感染为导致CHB的根源，如果控制不当可进展为肝硬化及肝细胞癌，因此积极地抗HBV治疗可延缓疾病的进展，改善CHB患者的预后转归[9]。核苷类似物的应用极大地提高了CHB的治疗效果，然而核苷类似物无法完全消除HBV，并且随意停药可造成疾病的反复，因此采取有效的手段评估核苷类似物治疗停止意义重大[10]。pgRNA是共价闭合环状DNA的直接产物，可反映肝内共价闭合环状DNA的活性[11]。HUANG等[12]研究指出，血清HBV pgRNA是CHB患者治疗12周时最初病毒学应答的预测指标，且为除HBV DNA外唯一可独立预测病毒学治疗应答的指标。另有报道指出，恩替卡韦治疗CHB期间HBV RNA的表达降低，研究者认为血清HBV pgRNA可预测CHB病毒学应答[13]。因此，探讨血清HBV pgRNA水平对预测核苷类似物治疗CHB的效果具有现实意义。

本研究167例CHB患者持续接受12个月的核苷类似物治疗后，42例(25.15%)CHB患者不应答，与既往研究报道结果相符[14-15]，表明替比夫定、替诺福韦、恩替卡韦治疗CHB效果相近。CHB获得不应答患者HBeAg阳性占比、HBV DNA载量、HBV pgRNA水平高于CHB获得应答患者，而CD4+/CD8+水平低于CHB获得应答患者，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示上述指标可能与核苷类似物治疗CHB效果有关。利用多因素Logistic回归分析显示，HBeAg状态、HBV DNA载量、HBV pgRNA均与核苷类似物治疗CHB效果有关，与既往研究报道结果相符[16-17]。有报道指出，血清HBV DNA与HBsAg表达水平与肝内共价闭合环状DNA活性线性相关，HBV DNA被用作判定CHB患者病毒学应答、疗效评价及停药的指标[18]。然而在核苷类似物治疗CHB过程中，CHB患者血清HBV DNA的消失不能用于判定肝内共价闭合环状DNA清除或处于转录沉默，将持续消失的HBV DNA作为核苷类似物停药标准时，经常出现CHB复发[19-20]。血清HBV pgRNA是HBV共价闭合环状DNA转录而来的HBV转录中间产物，多以病毒颗粒的形式存在于血清中[21]。有研究证实，恩替卡韦治疗CHB患者过程中，HBV pgRNA可反映肝内共价闭合环状DNA的残留及转录[22-23]。笔者利用ROC曲线分析血清HBV pgRNA预测核苷类似物治疗CHB效果的价值，结果显示AUC为0.855，最佳截断点为5.54 lg copy/mL，提示血清HBV pgRNA预测核苷类似物治疗CHB获得应答的效能较高，当HBV pgRNA降低至5.54 lg copy/mL时，可考虑停药。

综上所述，血清HBV pgRNA表达水平与核苷类似物治疗CHB获得应答有关，检测血清HBV pgRNA水平有助于预测核苷类似物治疗CHB的效果。