狂犬病病毒aG株在人用狂犬病疫苗中应用的研究进展

石磊泰 综述，李玉华 审校

中国食品药品检定研究院，北京 102629

狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的以中枢神经系统症状为主的一种动物源性传染病，病死率几乎100%。全球每年狂犬病死亡例数约60 000例，主要发生在亚洲和非洲，我国为狂犬病流行国家［1-2］，狂犬病疫苗是预防狂犬病的主要手段。1931年，研究者从狂犬病病犬脑中分离获得狂犬病病毒，随后通过兔脑传代，驯化为一种固定毒：1~10代的潜伏期不稳定，波动在10～26 d；30代后的潜伏期稳定在6 d。将该毒株命名为“北京株”，适应31代后用于制备狂犬病疫苗，该株病毒毒力略强于法国、德国、意大利、波兰、印度等国家的毒株，具有免疫原性好、遗传稳定的特点，用其生产的狂犬病疫苗有效性良好［3］。20世纪60~70年代，研究者将狂犬病病毒北京株通过豚鼠脑传代与原代地鼠肾细胞交替传代的方法适应于原代地肾细胞培养，用于狂犬病疫苗生产。该毒株免疫原性好、毒性稳定，可用于生产兔脑或羊脑狂犬病疫苗。由于脑组织疫苗接种后不良反应严重，且需连续注射14针，逐渐被淘汰。1965年，经多家机构合作，将狂犬病病毒北京株在豚鼠脑和原代地鼠肾细胞中交替传代15年，获得地鼠肾细胞适应株，命名为“aG株”，目前仍用于人用狂犬病疫苗生产［4-8］。本研究就狂犬病病毒aG株的传代适应方法、基因特性及其制备相应疫苗的免疫保护作用作一综述。

1 传代适应

1.1在原代地鼠肾细胞传代适应 1965年，经多家机构合作，用狂犬病病毒北京株在原代地鼠肾细胞传代适应，成功研制了原代地鼠肾细胞培养灭活疫苗，毒种的适应传代包括3个过程：①用狂犬病病毒北京株的兔脑固定病毒感染2～3周龄的地鼠肾单层细胞，于36～37℃培养约2周（期间更换培养基1～2次），弃上清液，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，加入适量新鲜制备的正常原代地鼠肾细胞悬液，混合培养2周；按上述方法进行消化，加入正常原代地鼠肾细胞继续培养（称为混合培养法），连续培养4代，病毒滴度达2～3 lgLD50/mL［4-5］。②将第4代病毒液直接接种于正常原代地鼠肾单层细胞中，培养约5 d；根据病毒繁殖高峰，取病毒培养上清，接种地鼠肾单层细胞继续传代。病毒滴度在10代以内均较低，繁殖高峰期约为20 d；在37～43代期间，滴度上升至4～4.5 lgLD50/mL，繁殖高峰缩短至8～10 d；44代后病毒滴度约稳定在4.5 lgLD50/mL，繁殖高峰期稳定在5～7 d；继续传至第68代，病毒滴度未增加，繁殖高峰未进一步下降［4-5］。在传代过程中，均未发现细胞病变，将这株地鼠肾细胞适应株称为“a”株。③为进一步提高a株的病毒滴度，将第55代a株病毒在豚鼠脑内和地鼠肾细胞交替进行传代，传至第3代时，该病毒的滴度提高至4.5～5.5 lgLD50/mL或更高，即aG株，用于生产原代地鼠肾细胞组织培养的疫苗［4-5］。

将aG株的生物学特性和稳定性与北京株固定病毒进行比较，结果表明，aG株对小鼠、豚鼠、家兔、狗和猴基本丧失了对周围神经的致病性，对中枢神经系统的致病性也显著降低；交叉保护和交叉中和试验表明，两者的抗原性相似，差异无统计学意义（P＞0.05）［4-7］。

1.2在V e ro细胞传代适应 20世纪90年代，有研究将aG株在Vero细胞上进行适应传代，传代后病毒滴度可提高至疫苗生产要求的水平［9-12］。蒋茨蕾等［13］也曾尝试用Vero细胞传代aG株，获得的培养物具有较低毒力及较高免疫原性。郑海发等［14］为使aG株适应Vero细胞，用提取的含3aG-5株病毒的豚鼠脑悬液按0.1 LD50/个的剂量感染Vero细胞，加入含0.7%牛血清Eagle′s的MEM（pH 7.6），于37℃静置培养48 h；更换加入含3%牛血清的MEM，34℃培养4 d，收集液体，即为3aG-V1株，采用相同方法继续传代，获得3aG-V35。有研究采用小鼠、豚鼠、家兔和犬为研究对象，通过不同途径感染狂犬病病毒3aG-V株，探讨该毒株的致病性及免疫原性，结果表明，狂犬病病毒3aG-V株潜伏期较长，在动物脑内不形成尼氏小体，表明该毒株是一种固定毒，对实验动物的致病性较弱，具有良好的免疫原性，可作为疫苗株生产Vero细胞狂犬病疫苗［14］。另有研究对3aG-V株进行了毒株形态、培养条件、致病性、免疫原性、毒力试验研究，并检测了病毒在中枢神经系统形成包涵体的情况，结果表明，狂犬病病毒3aG-V株抗原性好、培养产毒量高、毒力低、传代稳定、无突变，且灭活后有效性及安全性良好［15］。狂犬病病毒3aG-V株在Vero细胞上传代多次，滴度可达8.3 lgLD50/mL，具有良好的抗原性和免疫原性，并确定了狂犬病病毒3aG-V株在Vero细胞上的种毒量在0.1~0.01 LD50/个之间病毒滴度最高，表明3aG-V株可在Vero细胞上长期增殖，并认为其可替代原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗aG株进行Vero细胞培养，用于生产人用狂犬病疫苗［16-19］。

1.3在鸡胚成纤维细胞传代适应 王远征等［20］为探讨狂犬病病毒aG株对原代鸡胚成纤维细胞的传代适应性，将北京株10aG豚鼠脑毒种在鸡胚成纤维细胞上连续传代培养，取第11、21、31代病毒收获液，用小鼠脑毒力测定法测定病毒滴度，并采用正交试验筛选最佳病毒培养条件，按最佳比例接种病毒，绘制病毒生长曲线，同时进行特异性和免疫原性检测，结果表明，狂犬病病毒aG株对鸡胚成纤维细胞无明显的细胞病变作用，病毒含量随传代次数的增加呈上升趋势，第11、21和31代病毒收获液的效价分别为4.0、7.7、7.17 lgLD50/mL；经多次传代，最适培养条件为：细胞浓度1.5×106个/mL，接种比例1∶500，血清浓度2%，收获时间5 d。连续收获3次病毒后，细胞开始脱落，病毒滴度可达7.0 lgLD50/mL以上，中和指数可达8 500；第21代病毒制备的疫苗效价为2 IU/mL。上述结果表明，北京株10aG株豚鼠脑病毒株可适应鸡胚细胞的培养，为鸡胚成纤维细胞狂犬病疫苗的研究奠定了基础。

1.4在二倍体细胞适应 王辉等［21］在2013年申请了一项科技专利，即采用狂犬病病毒aG株在人二倍体细胞上传代与挑斑结合的方法传代培养狂犬病病毒aG株，当病毒滴度达4.7 lgLD50/mL后，将10倍系列稀释的病毒液与消化分散的2BS细胞共同接种至6孔板，进行挑斑，挑选出抗原含量高的病毒克隆后，继续在小方瓶中传代适应，获得狂犬病病毒aG株人二倍体细胞适应株，即CGMCC No.7307，但目前尚未见该项专利后续研究工作的相关报道。

2 基因特性

2.1糖蛋白（G）和核蛋白（N）的基因特性 狂犬病病毒G蛋白是决定抗原性及组织嗜性与毒力的最重要部分［22］。白宪鹤等［23］报道表明，狂犬病病毒地鼠肾细胞适应株3aG G蛋白序列共含1 575个核苷酸，编码624个氨基酸，4种核苷酸的组成分别为：A占27%、T占26%、C占22%、G占25%。3aG株的G蛋白核苷酸序列与巴斯德株（PV株）和国际标准攻击毒株（CVS株）的核苷酸序列同源性分别为91.17%和89.44%，氨基酸序列同源性分别为89.89%和86.83%；G蛋白膜外区部分特征抗原位点的比较显示，3aG株、PV株及CVS株有高度同源性。白宪鹤等［24］对N蛋白等进行了序列测定，结果显示，3aG株N蛋白全长含1 352个核苷酸，与CVS株的同源性为91.95%。2011年，郭秀侠等［25］将3aG株接种至Vero细胞中进行适应性传代，其中一项关于G蛋白序列的研究结果显示，aGV株与3aG、PV、CTN-1、CVS株和街毒株G蛋白基因序列同源性分别为99%、92%、84%、91%、84%。

2.2全基因序列的基因特性 李加等［26］于2013年进行了aG株全基因组测序，将aG株全基因组RNA分为8段进行RT-PCR分段扩增，其中，基因组5′端采用5′RACE法，PCR扩增产物克隆至载体pGEM-T中，测序拼接获得病毒的全基因序列；用DNAstar软件包中相应的软件对基因的全序列进行分析，并与国内外主要狂犬病疫苗生产株进行了同源性分析和主要抗原位点的比较。结果表明，aG株的基因组序列长为11 925 bp（GenBank登录号为：JN234411），属于Ⅰ型狂犬病病毒；aG株与人用或兽用狂犬病疫苗株（如PV2601、PM1503、SAG2、ERA、SAD B19、Flury-LEP、HEP-Flury和SRV9）全基因组的同源性分别为91.2%、90.0%、91.1%、91.3%、91.1%、90.5%、87.9%和87.9%。

赵雅静等［27］在2016年也进行了aG株的全基因测序，并根据疫苗生产工艺进行了传代。提取主种子批、工作种子批和疫苗原液RNA，用RT-PCR技术扩增全基因组；将目的基因片段克隆至载体pGEM-T中。应用DNAStar软件包分析aG株与GenBank中的4aGV参考株（JN234411）及18株基因型Ⅰ型狂犬病病毒参考株的同源性，结果表明，aG株全基因组由11 925个核苷酸组成，编码3 600个氨基酸。疫苗原液和主种子批全基因组核苷酸和氨基酸序列同源性均为100%，工作种子批和主种子批核苷酸及序列氨基酸序列同源性分别为99.97%和99.92%；aG株和4aGV全基因组核苷酸及氨基酸序列同源性为99.97%和99.9%，其与18株基因型Ⅰ参考株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.2%～97.6%和93.7%～98.3%；aG株和4aGV参考株全基因组氨基酸序列高度保守，主要功能区未发生变化。狂犬病病毒aG株在实验室长期生产和传代过程中，全基因组遗传特性稳定。

3 免疫保护效果

原代地鼠肾细胞培养aG株灭活疫苗经原代疫苗、Al（OH）3佐剂疫苗、浓缩疫苗、浓缩纯化疫苗、浓缩纯化去佐剂疫苗等一系列工艺改进和升级，自1984年以来，年剂量已超过100万人，总体预防效果良好，不良反应较轻，未见过敏性脑脊髓炎反应发生，但存在一些免疫失败病例，其原因可能是疫苗未浓缩、抗原量及效价较低（效价一般仅有1.3 IU/剂，未达到WHO规定标准，即≥2.5 IU/剂）导致的。为进一步提高疫苗质量，1993年以后，开始批量生产浓缩疫苗，其生产工艺与原疫苗相似，最终疫苗原液通过10万或30万分子量的截留膜浓缩3~5倍。疫苗年产量达500万~600万剂，以满足暴露后的需要，全国狂犬病病例从70年代的约每年6 000例下降至每年200～400例［28-29］。

3.1暴露前免疫保护 由于未纯化疫苗中含有一定量的杂质蛋白，大规模接种后一般过敏反应时有发生，浓缩疫苗的不良反应较为严重，如注射部位疼痛、大面积红肿、全身性荨麻疹、过敏性紫癜、血管神经性水肿等，也出现了休克、昏迷等严重不良反应，严重不良反应发生率为5%～10%，危及患者生命［30］。分析不良反应发生的原因主要是由于疫苗生产过程中残留了异种蛋白，如小牛血清、豚鼠脑组织、原代地鼠肾细胞蛋白等，因此需对狂犬病疫苗进行纯化，以去除异种蛋白，降低不良反应发生率。纯化方法为：将原液经层析或醋酸锌沉淀后采用Sepharose凝胶柱层析或DEAE-Sepharose-CI-6B离子交换法纯化，再经0.22μm滤膜过滤灭菌，有些厂家将传统的福尔马林灭活病毒改为1∶4 000β-丙内酯，最后加入Al（OH）3。

法国维尔博狂犬病疫苗及国产原代地鼠肾细胞生产的aG株狂犬病疫苗接种人体后均无异常反应。国产aG株狂犬病疫苗免疫3针后，低热、发红、硬结、皮疹等副作用发生率为0～9.7%，维尔博疫苗为0～9.1%，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；国产aG株狂犬病疫苗与维尔博疫苗免疫3次后抗体阳转率均达100%，抗体效价分别为9.8～24.2和9.7～17.8 IU/mL，两者差异无统计学意义（P＞0.05）［30］。用Vero细胞生产的aG株灭活疫苗已于1999年获得我国新药证书并投产，规格为1 mL/剂，均为加佐剂液体剂型。国内某厂家生产的Vero细胞疫苗按3、5针免疫程序接种348名志愿者，未发生中、重度不良反应；注射3次（27人）或5次（30人）后第14天，抗体阳转率达100%，抗体滴度分别为2.89和4.42 IU/mL，接种法国维尔博狂犬病疫苗3次（24人）后抗体阳转率也达100%，抗体滴度为2.13 IU/mL，两种疫苗差异无统计学意义（P＞0.05）［30］。国内另一厂家生产的Vero细胞狂犬病疫苗免疫311人，未发生中、重度不良反应；注射5次（34人）后第14天，所有抗体阳转率均为100%，抗体滴度为3.1 IU/mL［30］。

3.2暴露后免疫保护 用原代地鼠肾细胞制备aG株狂犬病疫苗，在河南、广西、江苏、河北等狂犬病流行区进行暴露后免疫观察，接种了301例暴露后患者，其中85例为轻伤，216例为中、重度咬伤或抓伤患者。对轻伤患者按14次注射方案进行皮下免疫；中度损伤患者于第0、7、14天分别进行1次肌肉注射；重度损伤患者于第0、7、14、24和34天分别进行1次肌肉注射。同时对伤人的可疑狂犬病动物进行病理活检，结果表明，85例轻度损伤患者中25例确诊为狂犬病街毒感染，216例中、重度患者中72例为狂犬病街毒感染，72例患者中有21例为严重咬伤，在第1次接种疫苗时同时注射了抗狂犬病病毒血清。免疫后7～36个月内未发生狂犬病，表明注射狂犬病疫苗进行暴露后免疫治疗是可行的［4，31］。另外，原代地鼠肾细胞制备aG株狂犬病疫苗的效果在疯狼集中咬伤患者的治疗中也得到了证实，该次事件中疯狼共咬伤31人，27例患者在1~2 d内注射了该疫苗，其中13例严重咬伤者合并注射了抗狂犬病病毒血清，随后2年半内，27例患者全部得到保护；其他4例患者中，3例头部重伤，但仅注射了疫苗，另1例未进行疫苗全程免疫，均于被咬伤后22~51 d患典型狂犬病导致死亡［32］。

4 小结

1980年以前，我国生产和使用的狂犬病疫苗是用石碳酸灭活的山羊脑组织悬液疫苗，该疫苗接种后不良反应严重，尤其是脑组织引起的变态反应性脑脊髓炎，免疫效果也较差。为解决这些问题，由多家机构合作，于1965年开始使用狂犬病病毒北京株通过原代地鼠肾细胞适应传代，获得aG株，并成功研制了原代地鼠肾细胞培养的狂犬病病毒灭活疫苗，该疫苗是通过采用福尔马林灭活，并加入Al（OH）3佐剂制备而成，于1980年取得生产许可证，开始正式生产和应用，并替代羊脑疫苗［6］，经一系列产业升级和改造后，目前仍在我国疫苗市场销售和使用，2015—2019年的批签发量分别为80万、80万、100万、120万和63万人份［33］。自2005年人用狂犬病疫苗实行批签发制度以来，陆续有多家疫苗企业开始研发、生产Vero细胞培养aG株的人用狂犬病疫苗，2015—2019年的批签发量分别为635万、710万、998万、600万和186万人份［33］，为我国狂犬病的预防和控制发挥了积极作用。