外泌体的提取、贮存及其临床应用进展

张芮浩，张晓勃综述，袁文欢，周海宇审校

1.兰州大学第二医院骨科，甘肃 兰州 730030；

2.甘肃省骨关节疾病研究重点实验室，甘肃兰州 730030；

3.内蒙古自治区包头一附院核磁科，内蒙古包头 014010；

4.兰州市西固区人民医院骨科，甘肃兰州 730060

外泌体是细胞分泌的纳米级细胞外囊泡，大小30～150 nm，携带核酸、蛋白质、脂质和其他生物活性物质，在人体的生理和病理过程中发挥重要作用。外泌体首先发生于内体膜的内陷，内陷后形成细胞内囊泡，随着小囊泡的积累，内体转化为多囊体。多囊体大部分进入溶酶体后被降解，其余的在与细胞膜融合后释放到细胞外，成为细胞外囊泡。外泌体最初由JOHNSTONE等［1］在体外培养绵羊网织红细胞时发现，当时被认为是“细胞灰尘”，为细胞处置自身废物的一种机制，因此并未引起注意。2007年，VALADI等［2］首次证实外泌体同时含有功能性mRNA和miRNA，它们可以转移至其他细胞，并在称为“外泌体穿梭RNA”的新位置发挥作用。自此，外泌体引起了广泛关注。与脂质体和其他纳米颗粒等载体相比，外泌体由于其内在特性，在疾病诊断和治疗领域具有广泛而独特的优势。但外泌体的提取纯化以及贮存等条件限制了其临床应用。因此，需进一步探索优化外泌体的提取和贮存条件，促进后续外泌体功能的研究。本文对外泌体的特性、提取和贮存手段及其临床应用进展作一综述。

1 外泌体的特性

外泌体的特征是小RNA的聚集，包括mRNA、miRNA、转运RNA（tRNA）和长链非编码RNA（lnc-RNA）［3-4］。这些RNA分子与蛋白质一起作为遗传物质，通过外泌体转移并在细胞间传递通讯信息［5］。外泌体通过与细胞膜或配体结合，将信号传递给受体细胞后，导致受体细胞的行为发生变化［6-7］。在外泌体生成和释放的不同阶段，外泌体货物和膜的组成会发生变化，从而导致异质性外泌体种群。外泌体所携带的脂质和蛋白质类似于起源细胞中的脂质和蛋白质，它们与受体细胞相互作用以触发货物释放或信号转导级联诱导，最终导致细胞活性或功能的改变［8］。与干细胞和其他成分相比，外泌体具有性质稳定、易保存、易转化等优点，且具有非免疫原性。其为无细胞靶向治疗的合适选择，可作为特定基因或治疗疾病的药物的载体［9］。

2 外泌体的提取纯化

当前用于分离外泌体的主要纯化方法包括超速离心法（ultracentrifugation，UC）、尺寸排阻色谱法、聚合物沉淀法（试剂盒法）。UC是通过离心作用分步去除细胞、细胞碎片和大囊泡，再沉淀外泌体。由于其操作简单，外泌体回收率高，是最常用的外泌体纯化方法。但UC会破坏外泌体的完整性，且蛋白质污染率高［10］。尽管有研究表明UC可有效地从黏度较低的液体（如培养基、尿液和灌洗液）中提取外泌体，但从黏性液体（如血清）中回收外泌体的效率较低［11］。研究显示，在外泌体颗粒和蛋白质回收率方面，尺寸排阻色谱法优于UC［12］。外泌体聚合物沉淀法是将含有聚合物的沉淀溶液与生物体液混合，从而沉淀外泌体。目前已有成熟的PEG-base商业试剂盒（如ExoQuickTM）。试剂盒提取方法可以获得纯度较高的外泌体，且操作简单，不需要高度精密的仪器设备。用外泌体RNA分离试剂盒获得的RNA含量高于UC［11，13］。

但上述外泌体的分离和提取方法较费时，而且很大程度上取决于预分离步骤。这些方法会导致外泌体和外泌体RNA的浓度、纯度以及大小发生变化［13-14］。使用商业提取试剂盒需大量的样品进行处理，试剂盒和试剂昂贵，操作繁琐且设备复杂，结果易出现偏差［15］。增加产量和纯度并保持其生物学特性的标准化分离方法是目前限制外泌体应用的主要挑战，开发更有效的外泌体分离方法将促进外泌体药物递送（如基于核酸的药物）系统的开发。外泌体鉴定方法包括形态鉴定（电子显微镜）、粒度测量（直径分析）和标记蛋白检测（蛋白质印迹），其中，透射电子显微镜用于清晰观察外泌体的大小和形状，被认为是金标准鉴定方法［16］。

3 外泌体的贮存

贮存温度是维持细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）活性的重要因素［17］。先前的研究表明，高温贮存减少了外泌体保留的数量和外泌体含量，而在-80℃下贮存则引起较少的变化［18-19］。因此，目前在磷酸盐缓冲液中通常的贮存条件是-80℃。最近的研究表明，低温会影响EV脂质膜的稳定性，而在低温下形成的冰晶会造成机械损伤，甚至损坏脂质膜，并导致其含量及相应的生物学功能丧失［20］。在20或4℃下保存1 d，EV的抗菌作用会大大降低。在-20℃下贮存28 d，会导致EV尺寸变化和抗菌功能丧失［21］。尽管在-80℃下贮存会对外泌体的数量和大小产生较大影响，但其可部分保留28 d的抗菌功能，极大改变了EV的结构和功能特性。当需要进行功能测试时，最好使用刚提取的EV［21］。由于外泌体的存贮时间较短，商业化外泌体无法确保其功能的完整性，需进一步完善外泌体的保存条件。

与先前研究不同，MAROTO等［22］发现，在冰冻条件下，外泌体的大小增加，在4℃下贮存的外泌体直径增加了10%，在-80℃下贮存的外泌体直径增加了25%，而且促进了多层囊泡的形成和聚集，影响外泌体的蛋白质含量。尽管研究报道在-80℃下贮存的外泌体大小存在差异，但均表明低温贮存条件会导致外泌体生物学功能逐渐丧失。

冷冻干燥或喷雾干燥是新开发的一种外泌体存储方法，可代替冷藏贮存，而且对外泌体的结构和功能维持更有益，但目前尚未摸索出最佳的保存环境［23-24］。此外，细胞外囊泡的不同来源和样品制备过程也会影响细胞外囊泡的质量和稳定性，如冻融循环次数的增加将导致EV粒子数量的减少和内容物的快速降解，有必要适当减少外泌体使用过程中的冻融循环次数［25-26］。

4 外泌体在肿瘤中的研究进展

恶性肿瘤一直是人类社会面临的巨大难题，虽然医学治疗方式已发生很大变化，但外科手术和全身化疗仍是主要的治疗方式，患者死亡率高，预后较差。外泌体作为一种非常有效的基因载体，避免了病毒载体的风险，其携带靶向基因药物微创治疗疾病，具有较大的临床应用前景。

其次，外泌体本身也在肿瘤的疾病发展中起重要作用。其通过促进血管生成［27］、侵袭转移［28］、免疫逃逸［29］以及耐药抗性［30］等方面参与肿瘤的癌症特性，miRNA作为外泌体携带的内容物在其中发挥至关重要的作用。这些miRNA可作为旁分泌药物调节肿瘤的微环境，包括免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞等［31］。那些在肿瘤和正常组织中表达差异的miRNA可作为肿瘤的标志物。此外，抑制或上调肿瘤中的RNA分子也可能是一种有效的治疗策略。

5 外泌体的应用

外泌体作为生物载体具有生物活性，可在细胞之间转运其内含物，从而导致受体细胞功能的改变［32］。其在医学领域具有许多潜在用途，研究广泛集中于恶性肿瘤治疗、药物传递和再生医学领域［33］。外泌体通过细胞间的通讯介导癌症的转移、耐药性以及免疫反应［34］。其不仅在肿瘤发生、血管生成和转移中起重要作用，还抑制肿瘤的进展［35］。由于外泌体几乎存在于机体分泌的所有体液中，而且可在体液中检测到，因此被认为是疾病诊断的无创或微创生物标志物，具有检测包括癌症在内的许多疾病病理状态的潜力［36］。它们存在于各种体液中，如血清、唾液或尿液，可轻松地从患者身上采集血液样本进行分离，然后用于鉴定外泌体中的特定RNA分子或蛋白质，是一种完美的无创诊断/预后技术［37-38］。外泌体由于其表面包含多种黏附蛋白，纳米颗粒大小和可变形性使其能够跨越主要的生物屏障，成为基因治疗的药物载体［39-40］。

研究发现，外泌体可同时发挥免疫激活和免疫抑制功能，肿瘤免疫疗法为肿瘤研究领域的新型疗法。来自免疫细胞和肿瘤细胞的外泌体部分充当肿瘤免疫学的调节剂，调节肿瘤的进展［41］。POGGIO等［42］发现，去除外泌体PD-L1后，会抑制肿瘤的生长。来自肿瘤的外泌体PD-L1抑制引流淋巴结中的T细胞活化，外泌体PD-L1代表1个治疗靶标，可克服目前对抗体疗法的耐药性。转移是肿瘤进展的关键因素，为癌症死亡的主要原因，也是外泌体介导肿瘤远处转移的通讯机制［43］。降低肿瘤外泌体至正常水平，可能是防止癌症恶化的有效疗法。目前的研究发现，外泌体可作为肿瘤疾病的治疗靶点［44］。目前，miRNA被认为是潜在的抗癌药物，但传递miRNA、蛋白质和化学药物的常规方法通常无法产生理想的效果。外源性miRNA在体内易降解，由于缺乏天然构象，外源性蛋白质无法执行所需的功能，所用化学药物对正常细胞具有致命性。使用外泌体作为载体可解决上述问题，外泌体传递的分子靶向药物作用于肿瘤细胞，可抑制肿瘤的生长和转移［45］。此外，其还可用于肿瘤的预后监控［46］。可利用外泌体作为生物标志物、疫苗和药物载体，并对其进行合理的修饰，以进行治疗性干预。

6 小结

外泌体的提取方法虽然具有多样化，但仍无法确定哪种方法绝对有效，目前，研究者可能更倾向于试剂盒提取法。此外，外泌体的贮存具有时效性，且受多种因素影响，需在提取后尽快使用，因此，开发新型贮存方法来保持外泌体的结构和生物学功能，具有极大的研究价值和临床应用前景。在临床应用方面，准确有效地鉴定、分离和量化外泌体仍面临巨大的挑战，将进一步探索外泌体在转化医学中应用的潜力，并为创建有效的临床诊断和治疗策略提供新的途径。