探讨PCR技术于检验沙门菌中的应用与进展

李立巍

桂林市疾病预防控制中心，桂林 541001

革兰氏阴菌中之一的沙门菌，属于肠道细菌科沙门氏菌类别，对不同血清感染的各种动物造成的各种病症被称为沙门菌病，常见的是误食各种发霉变质的食物造成的中毒，造成中毒的病菌，其中就包括沙门菌。接近90%是肉类、蛋类、奶类等畜牧产品［1］。此类畜牧产品具有较为丰富的营养元素，大大有利于沙门菌在此类产品中的生长繁殖。不仅如此，沙门菌的适应能力与生命力都较为顽强，可以在一定处于外部环境的食品中生存几个月之久。其不仅可以感染动物，还可以导致食用了大量沙门菌食物的人类受到侵害而引发食物中毒，是导致人类与牲畜之间共同患病的原因其一，在医学上有着极强的代表性。同时对食物的安全性具有严重的威胁性［2-3］。

目前沙门菌的检测方式更多是采用传统的检测方式，不仅周期性长，而且相对复杂繁琐。因此，针对沙门菌的检测如何实现快速且有效的检测技术研究具有重要的实用意义。随着生物科学技术的发展，依靠免疫学与生物学为标准的技术应用将进一步细菌细分检测范畴［4-5］。聚合酶链式反应（PCR）技术的广范应用，不仅进一步提高了对细菌的检测速度，而且还具有较为准确的检测结果依据。PRC技术不但可以从定性与定量两个维度进行检测，还有利于快速检测体系的建立与进一步提高检测反应灵敏度，其核心在于选择被检测目标的基因［6-7］。

沙门菌等致病菌概述

此类病菌是依附在人类与动物消化系统中的生化反应，与革兰阴性杆菌的抗原构成较为相似，是导致消化系统肠道患病的病菌之一，造成的疾病大致由两类组成：第一种是伤寒与副伤寒，第二种是较为常见的急性肠胃炎。据统计，全国范围内由沙门菌造成的食物中毒数量位列第1 位，其中细菌导致的食物中毒，大部分是沙门菌造成的；食品类别中进一步细分，肉类等占据绝对核心原因，因其富含更多种类的人体所需的营养元素，更有利于沙门氏菌的繁衍。如果食用带有大于一定数量的沙门菌的肉类食品，将造成人体被感染。沙门菌是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一［8-9］。沙门菌污染的食物被人类与动物食用，是该疾病重要的感染方式之一。

沙门菌检验技术

血液与排泄物是用于临床提取检测样本的基础，常用于已被感染的对象进行沙门菌的检测，食品安全检测原理与临床病料中实质性是相同的。但在食品检测分析应用中是受到因素制约的，首先是两者的沙门菌的含量是不同的，食品中的含量远远低于临床病料；其次食品本身易受到其他病原的干扰；最后经过人工处理的食品，经过外部因素干扰的作用，会导致沙门菌受到损伤或者细菌死亡［10-11］。传统检测方式具有检测时间长、反应过程繁琐、反应试剂较多以及灵敏度低等不足，而且检测方式是通过表面抗原，研究判断生化反应和血清学实验进行检测［12］。随着生物科学技术的快速发展，在实践中不断优化与提升检测手段，可以在更短时间内检测出目标检测物的结果，这类方式被称为快速检测。该检测技术对沙门菌以及其他样品病原PCR方法的专业体系已得到广泛的应用。

PCR技术

1、PCR概述

PCR 技术又称聚合酶链式反应，其原理是将指定的DNA 片段通过PCR 技术将其放大增多的技术方式，可理解为将提取的DNA 样本重新进行循环复制，将少量的DNA 进行更进一步的增多，这是PCR 的核心技术特征。PCR 是1985 被发明出来，其发明者是美国的专家Mullis，标志着此项技术的问世。PCR 仪是由聚合酶衍生而出的控制温度的技术设备，可以精准控制温度的变化过程，从而达到检测样本目的。

特异性强、灵敏度高、迅速精准、自动化程度高等是PCR 的特点，以惊人的速度被广泛应用，目前已经广泛应用于多个专业领域，同时又结合其他相关技术衍生出更多的PCR 技术［13-14］。PCR 技术原理是依托以单链DNA 为检测样品，基于检测需要的环境条件下，采用人工合成品为引物，基于PCR 技术手段进行增加检测样品DNA 的方式。这个过程主要分为3 个步骤：第一是高温变性，第二是低温复性，第三是适温延伸。3个环节流程为一个单位，循环往复，从而实现增多DNA 的目的。在整个PCR 实验过程中，需要重点关注的是因为温度变化会导致实验目标样本DNA 聚合酶丧失活性，需要在每次循环过程中进行补充增活操作，确保实验结果的精准有效性。此类实验检测方法存在一定不足，因此对PCR 的广泛普及与未来空间形成一定制约［15-16］。

2、PCR技术在沙门菌检测中的应用

⑴沙门菌检测技术一般可分为常规PCR、多重PCR、套式PCR。以上方法可单独运用，也可多种检测手段相结合，从而提高受检目标结果的精准度。

⑵常规PCR是根据特定提取物目标样品的特异保守序列设计引物，对待检样本DNA 进行扩增，通过对扩增终产物进行定量及定性分析，此方式具备灵敏度高、特异度好、检测周期短、简单便捷等特点［17-18］。但此技术同时也存在一定不足之处，例如出现假阳性的结果以及由于存在使用不同引物的情况，可能对检测实验结果造成一定的影响，造成结果的偏差性。因此，在利用PCR技术进行实验时，需要更为谨慎与专业的操作，严格按照要求进行实验，确保最终实验结果的精准性。詹铭等［19］通过检测目标样本中沙门菌的hilA 基因用作引物，扩增片段在497 by，进一步缩短检测结果的同时又提升精准度和灵敏度。汪琦等［20］通过invA的目的基因利用PCR 技术手段，在48 h 即可得出明确结果。把生肉、加工鸡肉、全脂乳粉列为研究样品，通过沙门菌的人工操作干预，检测结果与传统方式和BAx（r）系统检测结果相同，最终结果检出限是100 cfu/25 g，准确率达到100%。虽然通过PCR 技术手段进行检测，具有迅速、精准、周期短等优势，不过不足之处也较为明显，就是对于细菌是无法区别是否拥有活性。活性细菌是对食物中毒等致病菌来说检测的意义。常规PCR 在检测中容易受到污染，影响检测结果的精准性，不过目前伴随着PCR技术的迅速提升，影响检测结果精准性易受污染的因素已经消除。

⑶多重PCR 与常规PCR 只能针对1 对引物的优势在于可以增加2对以上引物，可实现增强DNA 的反应，此类方式与其他检测方式（常规PCR）在多个方面具有高度一致性，而且拥有更高效、更便利、成本低等优势。沙门菌等致病菌的检测手段上多重PCR 已被广泛运用，大大提高了检测速度；但多重PCR 检测手段也存在一定劣势，灵敏度、效率等低于常规PCR 检测手段［21］。因此，突破现有检测条件是大家所面对的问题，也是一起寻找研究解决的难点，把多种影响因素优化排查，最终建立适宜的多种PCR反应体系。

⑷实时荧光定量PCR：1996 年美国Applied Biosystems公司率先使用，在PCR反应体系中添加荧光基团，借助荧光信号积累实时观察PCR 反应过程，把标准曲线与被检测目标物通过定量分析方式的检测手段被称为实时荧光定量PCR 技术。此项技术的问世，完成了PCR 由定性到定量质的跨越。比常规PCR 具有更多优势，不仅解决了PCR 易受到污染的问题，而且具备更强的特异性与更高的自动化程度等特点，现在已经大规模用于沙门菌检测领域。岳昌武等［22］通过此技术，已经实现迅速、有效、精准地检测出目标物中沙门菌，而且灵敏度已经达到10 cfu/g，所需的检测时间仅4～10 h，即可对目标样本得出精准的检测结果。郑友限等［23］以食物和实验细菌为实验目标样本，实验采用实时荧光定量方式获得实验结果，与其他检测技术手段进行对比，此检测技术灵敏度可达102 cfu/ml，而且可在24 h 内获得精准结果，因此针对沙门菌的检测技术手段又取得更进一步的发展。钟伟军等结合荧光定量PCR实验所需的条件与自身特征的进一步研究，利用进行编码的实验目标，结合实验引物等相关需求，重新建立了新的实验检测方法。方平等［24］利用其他物质的特定性质，可精准进行沙门菌特征的结果反应，利用温度调节方式，从而实现细菌的识别分类，达到畜牧产品中沙门菌的检测识别技术，通过两种肉类目标样品实验得出结论，其灵敏度分别是13、12 cfu/25 g，而整个检测时间周期可在10 h内完成，此检测方式拥有方便、快捷、特异性强、灵敏度高等优势，但此检测方式也有检测成本高、检测设备要求高等不足。

结语

综上所述，针对沙门菌等致病菌检测技术中，具备简便快捷、准确、高效等特征的PCR手段是主要应用之一，目前已经被广泛应用，其具备的与传统检测手段不可相比的优势，尤其是近几年发展中迅速崛起的荧光定量PCR技术，不仅能大大缩短检测时间，而且还能进一步提高检测结果的精准度。随着科技水平的迅猛发展，以后将会有更多的新科技、新技术、新手段来助力沙门菌检测技术的迭代更新，并得到广泛普及与运用。虽然PCR传统检测方式与新技术相比存在很多不足，但依然在疾病的诊断与卫生学评价中占有不可或缺的一席之地。不论是哪种技术手段在实际运用中都会受到各种条件的约束，因此未来还需广大科研人员共同在PCR技术检测沙门菌等致病菌的方面进行更进一步的探讨。