虎杖及多种植物提取物的抗氧化功效研究

杜可欣 蒋一博 陈 军 牟维林

(烟台新时代健康产业日化有限公司，烟台 264006)

近年来，随着自由基学说迅速发展，衰老和多种疾病的发生已被证实与自由基的过量产生有密切关联。因此，想到达延缓皮肤衰老的效果可从抑制自由基的产生与清除现有自由基两方面进行研究，传统的抗氧化剂一般来源于化学合成，存在稳定性差、毒副作用强等缺点，而来自植物的天然抗氧化剂具有安全无毒、稳定性强、天然等优势更符合消费者要求，有些得到了极大的开发利用。天然抗氧化剂的研究一方面可为行业提供更安全高效的选择，另一方面也可为弘扬中草药植物成分贡献一份力量。

超氧化物歧化酶(以下简称SOD)是一种金属酶，广泛分布在微生物、动物和植物体内。它能够催化超氧阴离子自由基(O2-)歧化生成氧(O2)和过氧化氢(H2O2)，在机体氧化与抗氧化平衡中起到关键性作用，同时SOD作为机体中清除自由基的天然活性物质，在机体的自我保护系统中也起到至关重要的作用。DPPH清除测定法于1958年被提出，至今被广泛应用于生物试样与酚类等物质抗氧化能力的定量测定中，测定原理是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处具有强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，DPPH单电子与自由基清除剂进行配对，使其吸收逐渐消失，醇溶液显色反应开始减弱，显色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。

虎杖作为一种重要的中药材，被收录于药典中。因虎杖中含有黄酮类、酚类以及单糖类化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化等功效。虎杖提取物，主要由白藜芦醇和大黄素组成，研究显示白藜芦醇和大黄素表现出广泛的抗氧化特性。黄芩始载于《神农本草经》，别名山茶根，具有清热燥湿，止血的功效，用药历史悠远，黄芩提取物、包括有黄芩苷、黄芩素等，研究表明黄芩及其有效成分具有广泛的药理作用，如抗炎、抗氧化和免疫调节等。红景天生长在高海拔且极寒的地域，恶劣的环境造就了其超强的生命力，可作药用，能够补气清肺，益智养心。红景天根部的提取物主要成份为红景天苷和甙元酪醇，具有增强免疫功能、保护心脑血管及抗氧化的作用。甘草始载于《神农本草经》中，甘草以根及其根茎入药，主要成分是三萜类和黄酮类还含有生物碱等。甘草除了补脾益气、清热解毒等功效，在护肤领域被大家熟知的是美白功效。本研究比较了虎杖、黄芩、红景天及甘草的抗氧化作用，旨在为抗氧化产品的开发提供试验依据。

1 实验材料与方法

1.1 材料与试剂

黄芩、虎杖、红景天、甘草、葛根、玛咖、青梅、松花粉、HaCaT细胞、DPPH细胞、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 样品制备

1.2.1 原料前处理

表1 待检样品编码与原料前处理方法

1.2.2 待检样品溶液制备

取经过前处理好的1%浓度的待检原料溶液40μl，加入到3960μl培养液中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得浓度为10μg/g待检样品。

1.3 试剂配制

1.3.1 细胞培养及细胞裂解液的制备

37℃、5% CO2条件下，培养足够数量的HaCaT细胞，将细胞浓度调整到5个/ml，接入6孔培养板中，每孔加入3ml细胞悬液，培养12h后，弃上清，加入上述检测原料，继续培养24h后，弃上清，每个样品孔加入2ml的无血清培养液，用细胞刮将细胞转移到离心管中，超声探头保持在液面以下，将细胞超声破碎。功率为300W，冰水浴，每3～5s超声1次，间隔4次(每次间隔时间30 s左右)。

1.3.2 SOD活性检测试剂配制

①底物应用液的配制：底物储备液：缓冲液按1∶200的比例混匀配成底物应用液，现用现配，2℃～8℃可保存7天。

②酶工作液的配制：酶储备液：酶稀释液按1∶10的比例混匀配成酶工作液，现用现配，2℃～8℃可保存3天。

1.3.3 DPPH抑制率检测试剂配制

配制浓度为0.5mmol/ml的DPPH溶液：称取2.958mg DPPH，用甲醇溶解并定容于15ml的容量瓶中，避光保存于0℃～4℃环境中。

2 检测方法

2.1 SOD酶活性检测

按照表2检测程序对经原料溶液处理过的细胞进行SOD酶活性检测。

表2 检测程序列表

混匀，37℃孵育20min，波长450nm，酶标仪测定吸光度值，参考波长630nm。

酶活力抑制率计算:在本反应体系中SOD抑制率达到50%时所对应的酶量为一个SOD活力单位(U)。按公式计算SOD的抑制率：

当时，钱钟书的邻居林徽因女士也养猫，称家里那只猫是他们一家“爱的焦点”。两家的猫经常打架，钱家的猫太小，常常受邻居猫的“欺负”。

SOD抑制率(%)=

抑制率越大，表明测定样品的SOD酶活性越高。在本试剂盒测定原理中用抑制率代表SOD酶活性的变化，即抑制率代表样品处理后细胞SOD酶活性提高的百分比，如果抑制率越高则表明原料对培养细胞SOD酶活性的促进作用越强。

表2 DPPH的抑制率

2.2 DPPH抑制率检测

①取样品稀释液2ml及浓度为0.5mmol/ml的DPPH溶液0.5ml，先后加入同一具塞试管中，摇匀，在黑暗中37℃放置20min，以甲醇为空白在514nm测定其吸光度Ai。

②取0. 5ml 0.5mmol/ml的DPPH溶液与2ml甲醇混合，摇匀，在黑暗中37℃放置20min，以甲醇为空白在514nm测定其吸光度Ao。

③取2ml样品稀释液与0.5ml甲醇混合，摇匀，在黑暗中37℃放置20min，以甲醇为空白在514nm测定其吸光度Aj。

样品对DPPH的抑制率的计算:

抑制率(%)=[1-(Ai-Aj) /Ao]×100

3 结果与分析

3.1 各样品对SOD酶活性的影响

表3 待检原料对SOD酶活性的影响

图1 使用超氧化物歧化酶(SOD)测定

样品稀释万分之一后，使用酶标仪，在波长450 nm时检测其OD值。并且根据公式，与对照组相比，计算各样品组的SOD抑制率。其中3号样品抑制效果比较明显，3号为虎杖的醇提物。该结果表明虎杖醇提物中具有能提高细胞内SOD酶活性的成分，经3号样品处理后可使细胞内酶活性提高20%左右，从而提高了细胞的抗氧化性能。另外样品1-A号、样品4号、5号及8-A号也显示出一定的提高细胞内SOD酶活性的能力。

所谓的自由基就是当机体进行代谢时，能夺去氧的一个电子，这样这个氧原子就变成自由基。自由基很不稳定，它要从组织细胞的分子中再夺取电子来使自己配对，当细胞分子失去一个电子后，它也变成自由基，又要去夺取细胞膜或细胞核分子中的电子，这样又会产生新的自由基。如超氧化物阴离子自由基、羟自由基、氢自由基和甲基自由基，等等。在细胞中由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏膜的结构和功能。自由基对皮肤的损伤是一个重要的因素，对已生成的自由基进行清除，就可以有效的减缓皮肤的衰老。

超氧化物歧化酶简称SOD，按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜、锌金属辅基的称(Cu.Zn-SOD)，是最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是含锰金属辅基的称(Mn-SOD)，呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种是含铁金属辅基的称(Fe-SOD)，呈黄褐色，存在于原核细胞中。SOD是氧自由基的自然天敌，为自由基清除剂，广泛存在于生物体的各种组织中，能清除自由基O2-(超氧阴离子自由基)。而O2-具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症、肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。羟自由基在细胞中非常活泼，化学反应性极强，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏膜的结构和功能。自由基对皮肤的损伤是一个重要的因素，对已生成的自由基进行清除，就可以有效地减缓皮肤的衰老。

3.2 各样品对DPPH的抑制率的影响

用分光光度计在波长514nm时测定各样品的Ao、Ai以及Aj的OD值，根据公式计算出样品对DPPH的抑制率，用GraphPad软件作图2。各样品都具有抑制DPPH自由基的作用，其中样品5(葛根)、样品7(青梅)、样品1-B(黄芩水提液)的抑制作用比较明显。

图2 用DPPH自由基清除实验检测样品对清除能力的影响

在皮肤衰老的过程中，自由基对皮肤的损伤是一个重要的因素。对已生成的自由基进行清除，就可以有效地减缓皮肤衰老。DPPH 为1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种稳定的氮中心自由基，广泛用于定量测定抗氧化能力。本实验的原理是根DPPH自由基有单电子，在514nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除的药品存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计在波长514nm检测并进行快速的定量分析。

4 结论

综上所述，虎杖提取物具有明显的促进细胞内SOD酶活性的能力，可使细胞内SOD酶活性提高20%左右，黄芩、红景天提取物也显示出一定的提高SOD酶活性的能力，且各样品均具有抑制DPPH自由基的作用，作为天然的抗氧化成分，在护肤品领域具有一定的开发潜力。