沉默乙酰肝素酶联合那屈肝素对肺癌细胞的抑制作用及其机制

庄喜兵，袁素娟，张 琪，吕名鹤，程韵枫，乔田奎

(复旦大学附属金山医院肿瘤诊断与治疗中心，上海 201508)

肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，是癌症相关死亡的主要原因[1]。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是一种β-D-葡萄糖醛酸苷酶，能够识别和切割硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)链，从而参与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的降解和重构[2]。HPA还能促进几种与HS相关分子的释放和扩散，如生长因子、趋化因子、形态因子和酶，这些分子对肿瘤的发展至关重要[2]。此外，HPA的表达在几乎所有类型癌症中均高表达，提示HPA可能成为肺癌治疗的分子靶点。

上皮-间质转 化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是一个正常的生理过程，上皮细胞发生形态分化，其特征是去极化、细胞-细胞间接触消失和纤维母细胞样形态延长，在癌症的侵袭和转移中起关键作用[3]。EMT的生物学特性已经明确为上皮标记物的丢失，如E-cadherin和细胞角蛋白，以及间充质标记物的获得，如波形蛋白和纤维连接蛋白[4]。EMT是由多种信号通路中转录因子表达和激活介导的，包括转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)、表皮生长因子、Wnt、Sonic Hedgehog、Notch和整合素等[5-6]。已有研究[7-8]表明，肺癌转移和放化疗耐药与EMT密切相关。此外，非小细胞肺癌细胞可以通过EMT获得肿瘤干细胞样表型[9]。低分子量肝素是预防和治疗血栓形成的有效抗凝剂，其结构与HS蛋白多糖的侧链相似，可以竞争性抑制HPA活性，通过抑制HPA影响选择素生成，抑制细胞黏附和肿瘤血管生成发挥抗癌作用，并与细胞周期和凋亡有关[10]。为探讨HPA与EMT之间的关系，本研究旨在探索慢病毒介导内源性HPA的沉默与外源性那屈肝素(nadroparin)抑制HPA活性，两者联合对抑制A549细胞生长的作用及其潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

1.1.1 细胞系人肺腺癌A549细胞，购自中国科学院上海细胞所，用含10%胎牛血清、RPMI-1640培养液，置于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，将细胞传代至指数生长期使用。

1.1.2 主要试剂靶向HPA的3种不同序列及阴性对照短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)的慢病毒载体由南京凯基生物有限公司设计合成，序列分别为：阴性对照shRNA，5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTCT-3′；shRNA1，5′-GCTCTGTAGATGTGCTATACA-3′；shRNA2，5′-GCAATGAACCTAACAGTTTCC-3′；shRNA3，5′-GCAAGCGTGCAAGGTTCAAAG-3′。慢病毒转染增强剂凝聚胺(polybrene)购于南京凯基生物有限公司。嘌呤霉素购自EMD Millipore公司。那屈肝素由葛兰素史克生产，商品名为速碧林。CCK-8试剂盒购于东仁化学科技(上海)有限公司，用于检测细胞增殖。ELISA试剂购于R&D Systems，用于检测培养上清中TGF-β1的浓度。基质胶Matrigel和transwell室购自BD公司。RNA快速提取试剂盒购于上海奕杉生物科技有限公司。Prime ScriptRTMaster mix和SYBR Premix Ex Taq购自TaKaRa生物科技有限公司。兔抗HPA、TGF-β1、磷酸化Smad2/3、锌指E盒结合同源框1(ZEB-1)、锌指转录因子SNAIL、E钙黏蛋白(E-cadherin)、N钙黏蛋白(N-cadherin)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)购于瑞昊生物科技有限公司。兔抗TWIST多克隆抗体购自Cell Signaling Technology(CST)公司。山羊抗兔HRP二抗和小鼠抗GAPDH单抗购自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 慢病毒转染建立HPA沉默的A549细胞株及验证

转染试验设5组，分别为空白对照组（A549细胞）、阴性对照组（转染阴性对照shRNA序列）、转染HPA shRNA1/2/3共3个沉默组。将指数生长期A549细胞按2×105个/孔的密度接种于6孔板中。置于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24 h后，用PBS洗涤细胞，加入慢病毒感染细胞(感染复数=10)，同时加入2.5μg聚凝胺以增强感染效率。感染48 h后，用嘌呤霉素筛选出稳定沉默HPA的A549细胞株，流式细胞术检测带GFP荧光的细胞比例以观察病毒感染效率。收集各组细胞，RNA快速提取试剂盒提取细胞总RNA，使用PrimeScriptTMRT Master反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA样品。引物序列由上海生工生物有限公司合成，HPA引物序列：上游5′-TCCTGCGTACCTGAGGTTTG-3′；下游5′-CCATT CCAACCGTAACTTCTCCT-3′。β-actin引物序列：上游5′-GTCTGCCTTGGTAGTGGATAATG-3′；下 游：5′-TCGAGGACGCCCTATCATGG-3′。采用常规实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)检测细胞HPA mRNA表达量。同时用Western blot检测HPA蛋白表达水平。主要步骤如下：8%SDS-PAGE分离各组细胞总蛋白并转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)。用含5%脱脂牛奶的TBST在室温下封闭1 h，用抗HPA一抗(1∶1 000稀释)，4°C下孵育过夜，GAPDH抗体作为内参，TBST洗膜3次，滴加HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000稀释)。PVDF膜用TBST再次洗涤，蛋白条带用超敏发光液(ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate，EMD Millipore)显影，Tanon-4500凝胶成像系统和GIS ID分析软件v4.1.5(Tanon科技有限公司)进行半定量分析。以验证慢病毒感染效果，筛选出最佳慢病毒序列进行后续实验。

1.3 抑制实验分组

抑制实验按处理方式不同，共设6个组：空白对照组(A549细胞)、阴性对照组(转染阴性对照HPA shRNA序列的A549细胞)、沉默HPA(转染shRNA3的A549细胞)组、空白对照+那屈肝素组、阴性对照+那屈肝素组、shRNA+那屈肝素联合组，那屈肝素浓度为100 U/mL，培养体系2 mL，总剂量200 U，处理48 h后进行相关检测。

1.4 CCK-8试剂盒检测细胞活力

将各组细胞以5×103个/孔的密度接种到96孔板中，培养24 h。按1.3分组处理后加入CCK-8试剂(10μL/孔)，37℃下孵育1 h，在450 nm波长下检测细胞吸光度，按下式计算细胞活力。

细胞活力=D(450)处理组/D(450)空白对照组×100%

1.5 细胞培养液中TGF-β1浓度测定

细胞接种于6孔板，密度约为2×105个/孔，按1.3分组处理后收集细胞培养液，使用ELISA试剂盒(R&D Systems，Inc.)说明书操作测定TGF-β1浓度。

1.6 细胞迁移和侵袭实验

细胞处理同1.3，取2×104个处理后的细胞接种于transwell上室，加入200μL无血清RPMI-1640培养基，并将上室置于500μL含15%FBS RPMI-1640培养基的下室中培养48 h，然后加0.1%结晶紫在室温下染色30 min，200倍光学显微镜下观察穿过上室的细胞。细胞侵袭实验中，transwell上室预涂基质胶，其余操作同迁移实验。细胞分析使用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics公司)。

1.7 Western blot检测相关蛋白

细胞处理方法同1.3，收集细胞后用8%～10%SDS-PAGE分离各组细胞总蛋白并转至PVDF膜。所用抗TGF-β1、磷酸化-Smad2/3、ZEB-1、SNAIL、TWIST、E-cadherin、N-cadherin和MMP-2，一抗和二抗稀释比例均为1∶1 000，具体操作步骤同1.2。

1.8 统计学处理

使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。实验均重复3次，数据以±s表示。Student-t检验用于比较两组之间的差异。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPA沉默A549细胞株的建立

慢病毒转染A549细胞后，经嘌呤霉素筛选，在荧光显微镜下可以看到感染细胞呈现不同强度的绿色荧光，流式细胞术检测不同shRNA的效率在80%～99%之间(图1)。qPCR分析显示，与空白对照组相比，3种不同的shRNA均不同程度地沉默HPA的表达，差异均具有统计学意义，并且shRNA3组HPA mRNA表达下调至21%(t=359.594，P＜0.01，图2A)；Western blot结果显示，shRNA3组HPA蛋白表达显著降低(t=90.780，P＜0.01，图2B)。可以看到，shRNA3沉默HPA的效果最强，因此选择shRNA3转染构建的A549细胞株进行后续实验。

图1 荧光显微镜及流式细胞术观察慢病毒转染效果

图2 HPA沉默效果验证(n=3)

2.2 HPA沉默联合那屈肝素抑制A549细胞活力

CCK-8法检测HPA沉默加或不加那屈肝素处理后A549细胞的活力。结果如图3所示，与空白对照组比较，阴性对照组未抑制细胞活力，单独那屈肝素处理或HPA沉默可使细胞活力下降(P＜0.05)，而两者联合抑制A549细胞增殖的作用更为显著(P＜0.05)。具体从细胞活力值来看，联合组细胞活力只有空白对照组的48.92%，空白+那屈肝素组为83.45%，阴性对照+那屈肝素组为83.08%，联合组与后两者比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

图3 沉默HPA和/或那屈肝素对A549细胞活力的影响

2.3 HPA沉默联合那屈肝素抑制A549细胞TGF-β1表达

TGF-β通路是EMT过程中的核心信号通路之一[11]。与空白对照和阴性对照组相比，ELISA检测结果显示在A549细胞中沉默HPA或经那屈肝素处理后TGF-β1水平明显降低(图4A，P＜0.05)。Western blot检测发现HPA沉默和那屈肝素均可下调细胞TGF-β1蛋白的表达，联合处理抑制效果更明显(图4B，P＜0.05)。

图4 细胞培养液TGF-β1浓度及A549细胞中TGF-β1蛋白表达检测结果

2.4 HPA沉默联合那屈肝素抑制A549细胞迁移与侵袭能力

细胞的迁移和侵袭对体内恶性肿瘤的发生发展至关重要。与空白对照组和阴性对照组相比，单独HPA沉默或那屈肝素均抑制了细胞的迁移能力(P＜0.05)。与其他组相比，联合组抑制细胞迁移效果最显著(P＜0.05)。在细胞侵袭实验中也观察到了类似的结果。综合上述结果表明，HPA沉默抑制A549细胞的迁移和侵袭能力，而联合那屈肝素处理则增强了这种抑制作用，具有协同作用，见图5。

图5 细胞迁移与侵袭实验检测结果

2.5 HPA沉默联合那屈肝素抑制TGF-β1信号通路相关蛋白的表达

见图6。与空白对照组比较，那屈肝素单独处理可抑制A549细胞中SNAIL、TWIST和N-cadherin的表达水平，而E-cadherin的表达则增加(P＜0.05)。p-Smad2/3、ZEB-1和MMP-2表达水平未见明显变化(P＞0.05)。此外，与空白对照组比较，单独HPA沉默A549细胞中p-Smad2/3、ZEB-1、SNAIL、TWIST、N-cadherin和MMP-2的表达水平降低(P＜0.05)，同时E-cadherin的表达水平升高(P＜0.05)，两者联合作用差异更显著(P＜0.05)。见图7。

图6 Western blot检测TGF-β1信号通路相关蛋白的表达

图7 TGF-β1信号通路相关蛋白表达

3 讨论

乙酰肝素酶(HPA)在肿瘤进展、促凝活性、子痫前期和炎症等多个病理过程中发挥着重要作用，并对硫酸乙酰肝素的降解有影响[12]。硫酸乙酰肝素降解过程中肝素结合生长因子的释放会影响肿瘤微环境，从而影响基因表达，并通过与跨膜蛋白相互作用增强自噬、转移以及血管生成[13]。多项临床研究表明，HPA活性升高与肿瘤进展、转移增强和预后不良相关[14-15]。相反，抑制HPA则与抑制肿瘤有关。Lou等[16]研究表明，从牛蒡子中提取的HPA抑制剂arctigenin可下调HPA的表达，抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力。

上皮间质转化(EMT)起源于胚胎学，以改变细胞表型为特征，影响肿瘤的致瘤性过程，尤其是在肿瘤进展和转移过程中起重要作用[17-18]。文献[19]报道，EMT可导致肿瘤干细胞的发展，并与肿瘤侵袭、转移、复发和放化疗耐药性相关。肿瘤微环境中癌细胞之间的相互作用可以通过自身和/或旁分泌介质，如生长因子、细胞因子和ECM蛋白，诱导EMT[20]。Shah等[21]报道HPA表达与EMT相关分子基因表达在胃印戒细胞腺癌组织中是一致的。因此，我们推测HPA活性与EMT密切相关。然而，HPA和EMT之间的确切联系仍不清楚。

那屈肝素与HS蛋白多糖的HS侧链结构相似，可以竞争性抑制HPA活性。本课题组前期研究发现，那屈肝素在抑制细胞活力、侵袭和转移方面具有较强的抗肿瘤作用[22]，这也是本研究给药的依据。本研究通过干扰HPA合成，并用那屈肝素处理抑制HPA的活性，证明联合处理在体外具有协同抗肿瘤作用，显著抑制了细胞活力、迁移和侵袭能力。

为了进一步探索那屈肝素抗肿瘤作用的分子机制，本文观察A549细胞处理后EMT过程相关分子的变化。EMT诱导转录因子的表达和激活与多种信号通路相关，TGF-β信号是与EMT相关的特征性信号通路[23]。TGF-β配体与相应的受体(TGFβR2和TGFβR3)结合，导致I型受体(TGFβR1)磷酸化，这需要转录因子Smad2和Smad3参与，Smads被磷酸化，从而激活转录因子，诱导编码EMT转录因子的表达，包括SNAIL、TWIST和ZEB-1[24]。这些转录因子导致上皮标记物(如E-cadherin和occludens 1)的表达或功能丧失，以及间充质标记物(如N-cadherin、vimentin、纤维连接蛋白和a-平滑肌肌动蛋白)和蛋白酶(如MMP-2/9)的增加[25]。有关低分子肝素与EMT之间的关系研究较少，Ponert等[26]发现低分子肝素减少胰腺和前列腺癌细胞中血小板诱导的上皮-间充质转化，但具体机制未深入研究；Zhong等[27]报道了Fraxiparine可以通过抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路调控CXCL12-CXCR4轴抑制肺癌细胞活性。本研究为探索那屈肝素与EMT之间的关系及其可能的调控机制，检测了HPA沉默和/或那屈肝素处理后A549细胞中TGF-β1的分泌和表达，结果表明两者均抑制了TGF-β1的分泌和表达，尤其是在联合处理组这种作用更显著。值得注意的是，TGF-β1表达下调，磷酸化Smad2/3水平降低，相应下游EMT相关转录因子ZEB-1、SNAIL和TWIST的表达也出现不同程度的下调，E-cadherin上调，N-cadherin和MMP-2表达的下调。而且，那屈肝素单独处理抑制了SNAIL和TWIST的表达水平，而ZEB-1的表达并无明显变化。此外，HPA沉默抑制了SNAIL、TWIST和ZEB-1的表达水平，而联合处理组却未表现出增强的抑制，这表明可能有其他因素参与了这些重要转录因子的调控。HPA沉默和那屈肝素诱导的这些分子表达水平的变化导致了协同抗肿瘤作用，表现为抑制细胞活力、迁移和侵袭。

综上所述，本研究结果揭示了HPA在A549细胞恶性行为中的重要性，并表明沉默HPA与联合那屈肝素处理对肺腺癌A549细胞具有协同抗肿瘤作用。其分子机制可能与TGF-β1表达的下调有关，TGF-β1下调磷酸化的Smad2/3以及参与调控EMT的3个重要转录因子ZEB-1、SNAIL和TWIST的表达水平降低，导致抑制间充质标记物(N-cadherin和MMP-2)的表达，同时上调了上皮标记物(E-cadherin)的表达。因此，通过HPA沉默联合那屈肝素抑制EMT过程可能为肺癌治疗提供一种新的策略。然而，还需要包括体内动物模型和其他潜在的信号通路的进一步研究，以验证HPA联合那屈肝素的抗肿瘤作用及其分子机制。