人参培养须根的大鼠致畸试验

刘 欢，梁 菲，李 莹，吴莎莎，曹 璨，徐建文，刘 影，

(1．哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科，黑龙江 哈尔滨 150001；2．哈尔滨医科大学食品药品安全评价中心，黑龙江 哈尔滨 150001)

人参为五加科多年生草本植物人参(Panax ginseng C.A.Mey)的干燥根，其主要成分包括人参皂苷、人参多糖及非皂苷成分等[1]。现代药理学研究表明，人参具有改善记忆力、抗氧化、抗疲劳、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤以及提高免疫力等功效[2-4]，因此人参在功能性食品和人体健康研究领域受到越来越多的关注[5]。国内外市场对人参的需求不断增加，为了解决人参资源的短缺问题，人参组织培养物即人参培养须根(人参为不定根)生产培养技术被逐渐应用于人参及其生物活性成分的生产[6]。

人参培养须根可应用于食品、保健品、药品和膳食补充剂等，并且在日本、韩国等已经实现了产业化[7]。近年来，我国也开始了人参培养须根的培养研究，但大部分集中在其培育及活性成分方面[8-9]，对其毒性研究鲜见报道。课题组之前的实验对其急性毒性、遗传毒性等进行了初步评价[10]，但未对其致畸性进行探究。因此，本文对人参培养须根进行致畸性检测，为其安全开发利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 受试物

人参培养须根由东北林业大学生命科学院提供。人参培养须根由5年生园参须根诱导而来。培养平台为1吨级植物生物反应器，接种量6 kg，培养基600 L，培养温度24℃，培养时间65 d。样品为人参培养须根烘干样，外观呈淡黄色粉末，总皂苷含量2.6%。该样品推荐用量为每日2 g，成人体质量以60 kg计，则样品用量相当于0.033 g/kg。

1.2 动物

SPF级性成熟SD大鼠(90～100 d)，雌性80只，雄性40只，均购自辽宁长生生物技术实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(辽)2010-0001；在SPF级动物实验中心(屏障环境)饲养，使用许可证号SYXK(黑)2017-008，温度为21～23℃，湿度为55%～58%。实验动物所用的清洁级饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，生产许可证号SCXK(京)2009-0012。所有操作均符合哈尔滨医科大学实验伦理学要求(审批号HMUIRB20210004)。

1.3 主要试剂与仪器

甲醛和冰乙酸(北京现代东方精细化学品有限公司)，氢氧化钾、水合氯醛和茜素红(国药集团化学试剂有限公司)，饱和苦味酸(上海信誉生物技术有限公司)，乙醇(天津市天力化学试剂有限公司)等。

CX21生物显微镜(日本奥林巴斯公司)，Motic SMZ168-BL型体视显微镜(麦克奥迪事业集团有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 剂量设置根据《食品安全国家标准 致畸试验》中的剂量设置和前期研究基础[10]，受试物剂量为2.0 g/kg(高剂量组)、4.0 g/kg(中剂量组)、8.0 g/kg(低剂量组)，分别相当于人体推荐剂量的60.5、121、242倍。由于受试物密度小，膨胀性高，最大可灌胃剂量为5.0 g/kg，而本实验所需受试物浓度大，不适合灌胃，所以将样品掺入饲料中。本课题组前期90天喂养实验[10]将大鼠摄食量设置为体质量的8%，考虑到孕鼠的实际摄食量高于正常雌性大鼠，因此将摄食量以体质量的10%计算，则相当于饲料中添加样品剂量分别为20.0、40.0、80.0 g/kg。用酪蛋白调节各组蛋白质与对照组相同，对照组给予基础饲料。

1.4.2 试验方法将雌雄以2∶1比例合笼。每日早晨检查雌鼠阴栓，发现阴栓则认为该动物已交配，当日作为受孕“零天”，记作GD0。若5 d内某只雌鼠未交配，则更换雄鼠。将检出的受孕大鼠按体质量随机分到各组，每组16只，并编号、单笼饲养。在大鼠妊娠的6～15 d通过饲料连续给予受试物，对照组给予基础饲料。动物自由摄食及饮水，在妊娠的第0、6、9、12、15、20天称量孕鼠体质量，每日对动物进行一般行为观察。在大鼠妊娠第20天断头处死，迅速剖腹取出子宫称取子宫连胎质量和子宫质量，以得出妊娠动物的净增质量，记录总着床数、总黄体数、活胎数、早死胎数、晚死胎数及吸收胎数。处死时对所有动物进行肉眼观察，保存肉眼发现有改变的脏器。逐一记录胎仔性别、体质量、体长，检查胎仔外观有无异常。将存活胎鼠的1/2放入乙醇中固定3周，茜素红染色，制作为胎鼠骨标本并进行检查；另1/2胎鼠用Bouin's液固定2周，制作胎鼠内脏标本并进行检查。

1.5 统计学处理

使用SPSS 19.0进行数据分析，孕鼠体质量、增质量、子宫质量、总着床数、总黄体数、吸收胎数、活胎数、死胎数、胎仔体质量、体长等计量资料用单因素方差分析，内脏畸形率、骨骼畸形率等计数资料采用χ2检验。对胎仔的相关指标统计以窝为单位。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 人参培养须根对孕鼠一般状况及体质量的影响

实验期间，各组大鼠一般状况良好，被毛整洁，行动灵活，反应敏捷，进食饮水正常，生长发育良好，未见流产或早产等异常反应及体征。与对照组相比，各剂量组孕鼠体质量差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。表明人参培养须根对孕鼠的体质量无明显影响。

表1 人参培养须根对孕鼠体质量和摄食量的影响(g，n=16)

2.2 人参培养须根对胚胎早期发育的影响

结果见表2。与对照组相比，人参培养须根各剂量组对胎鼠死亡率、胚胎吸收率、窝平均活胎数均无明显影响(P＞0.05)。

表2 人参培养须根对大鼠胚胎早期发育的影响

2.3 人参培养须根对胎鼠生长影响

结果见表3。与对照组相比，人参培养须根各剂量组子宫质量、胎鼠体长、体质量的差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表3 人参培养须根对胎鼠生长的影响

2.4 人参培养须根对胎鼠骨骼发育的影响

结果见表4。与对照组相比，不同剂量的人参培养须根胎鼠的肋骨发育无明显影响(P＞0.05)，胎鼠骨骼正常发育率均在98%以上。

表4 人参培养须根对胎鼠骨骼发育的影响

2.5 人参培养须根对胎鼠内脏发育的影响

结果见表5。与对照组相比，不同剂量的人参培养须根对胎鼠内脏发育无明显影响(P＞0.05)。

表5 人参培养须根对胎鼠内脏发育的影响

3 讨论

人参作为传统名贵中药材，不仅具有极高的药用价值，近年来在保健品领域也受到越来越多的关注[11-12]。目前，人参野生资源稀少，而栽培人参由于栽培周期长、农药和重金属污染等各种各样的问题无法完全满足市场需求。利用细胞工程手段通过培养植物细胞、组织或器官获取有效物质成为一种有效途径。人参细胞和根系培养物生长快速，代谢产物稳定，已经广泛作为人参田间栽培的替代品[13-14]。近年来，我国也开始了人参培养须根的培养研究，但大多集中在其培育及活性成分方面，人参培养须根研究中最主要的活性成分人参皂苷也被一些研究指出可能具有致畸毒性。Liu等[15]通过全胚胎培养发现，人参皂甙Rb1对大鼠、小鼠胚胎具有直接的致畸作用，主要表现在冠臀长度、头长和体节数的减少。另外有研究提出，人参皂甙的致畸性具有浓度依赖性，越低的浓度可能会导致越严重的畸形，使得这种毒性更容易被忽略[16]。但也有研究认为，产生致畸作用的人参皂苷剂量远远超过人类正常摄入量，所以在女性怀孕期间正常服用人参并不会对自身及其胎儿产生不良影响[17]。因此，基于人群研究和动物实验的这种矛盾结果，有必要对不同浓度的人参培养须根进行致畸性研究，为其安全应用提供科学依据。

本实验按照GB 15193.14-2015《食品安全国家标准 致畸试验》的要求进行了致畸试验[18]。结果显示，与对照组相比，在人参培养根须为2、4和8 g/kg剂量下，受孕大鼠的体质量未表现出明显变化，胚胎总着床数、总黄体数、死胎数、活胎数、吸收胎数无显著差异，同时对胎鼠外观、骨骼、内脏无明显致畸作用。表明在本研究条件下，人参培养须根无母体毒性、胚胎毒性和致畸性，未观察到有害作用剂量。本课题组前期对人参培养根须进行了急性毒性和90天喂养实验，均未发现其任何毒性作用，本研究证明了人参培养根须无致畸作用，完善了人参培养根须毒性作用评价证据，为人参培养须根的安全应用提供了一定的毒理学支持，为其将来进一步在药品、食品、化妆品等下游领域的应用提供了基础数据。