DNA依赖性蛋白激酶催化亚基在非同源末端连接修复中作用的研究进展

张天枫，赵乐天，廖明星，李仁燕

(国家卫生健康委出生缺陷与生殖健康重点实验室，重庆市人口和计划生育科学技术研究院，重庆 400020)

DNA是最重要的遗传物质，在维持机体新陈代谢和平衡的生命活动中，DNA持续发生不同程度的损伤，其中双链断裂(double-strand break，DSB)最为严重且普遍存在，每个细胞每天大约经历10～100次DSB[1]。造成DSB的因素有外源性(电离辐射、化疗药物和机械损伤等)和内源性(氧化自由基、细胞代谢产物与复制叉崩塌等)。病理性DSB会导致细胞生长停滞、细胞死亡和染色质重排，后者易造成癌基因的活化或抑癌基因的失活，导致肿瘤的发生发展[2]。当细胞发生DSB后，主要有两条修复途径，即同源重组(homologous recombination，HR)修复与非同源末端连接(nonhomologous DNA end joining，NHEJ)修复。HR修复依赖完全相同的同源染色体为模板进行精准修复，主要发生在细胞S和G2期[3]。NHEJ途径则不需要修复模板，通过修复相关因子，直接连接损伤的DNA两端，修复速度快，但容易产生错误(包括缺失、插入和点突变)，可在整个细胞周期发生，主要发生在G0/G1期[4]。当高能粒子或射线诱导DSB，则优先通过NHEJ途径修复损伤的DNA[5-6]。

经典的NHEJ修复(classical NHEJ，C-NHEJ)过程包括由Ku70/80组成的异二聚体对DSB的识别，募集DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)至损伤的DNA末端，内切酶Artemis对DNA末端剪切，多聚酶填补空缺脱氧核苷酸，再由连接酶复合体X射线交叉互补蛋白4(X-ray cross-complementing protein 4，XRCC4)、XRCC4样因子(XRCC4-like factor，XLF)和连接酶IV(ligase IV)，连接损伤的DSB两端，修复成完整的DNA链[7]。由Ku70/80异二聚体与DNA-PKcs形成的DNA-PK复合体，在NHEJ修复过程中发挥关键作用。其中DNA-PKcs属于磷脂酰肌醇3-激酶样蛋白激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase-like protein kinase，PIKK)家族成员，其激酶活性在NHEJ修复过程中发挥至关重要的作用，当DNA-PKcs激酶失活，导致辐射敏感性和DSB修复缺失的增加，也可导致可变区(variable，V)、多样区(diversity，D)、连接区(joining，J)重组与免疫缺失[8]。本文综述了DNA-PKcs的蛋白结构特征，及其如何被募集到DSB位点，如何被激活发挥NHEJ修复作用，同时结合目前新的研究发现，总结DNA-PKcs自身构象的变化对其发挥生物学功能的影响，为进一步深入研究DNA-PKcs在DSB修复中的重要作用以及相关疾病的发生提供理论基础。

1 DNA-PKcs的结构

DNA-PKcs由4 128个氨基酸组成，含有一个N端HEAT结构域，随后是FRAP、ATM和TRRAP(FAT)结构域、激酶结构域和一个短C端区域称为FATC结构域(图1)[9]。N端HEAT结构域中的重复序列是DNA-PKcs所特有的，它和中间结构域M-HEAT形成螺旋，也称为圆形支架，发挥着与Ku异二聚体及DNA末端结合的关键作用[10-11]。同时在M-HEAT结构域中，主要有两个磷酸化位点簇，ABCDE(T2609、S2612、T2620、S2624、T2638和T2647)与PQR位点簇(S2023、S2029、S2041、S2051、S2053和S2056)[12-15]，分别以T2609与S2056位点为代表[16]。研究表明，当DNA-PKcs与Ku70/80及DNA末端结合后，ABCDE簇发生自磷酸化或被ATM磷酸化，使DNA-PKcs构象发生变化，激活内切酶Artemis对DNA末端剪切，促进DNA-PKcs的PQR发生自磷酸化，进而使DNA-PKcs与Ku蛋白复合体解离，释放DNA-PKcs对DNA末端的物理阻断，有利于DNA末端连接酶发挥作用[17]。

图1 DNA-PKcs的结构[9]

由于DNA-PKcs相对分子质量太大，难以通过重组方式在细胞中表达，阻碍了其在细胞中功能的研究。通过对跨物种的DNA-PKcs序列分析，发现了高度保守且维持重要作用的氨基酸序列，其中包括M-HEAT结构域中的Forehead(892-1 289 aa)、NUC194(1 815-2 202 aa)和YRPD(2 772-2 784 aa)序列，以及FAT和激酶催化结构域[9]。值得注意的是，通过比对分析脊椎动物、无脊椎动物、变形虫、卵菌、霉菌和植物的YRPD结构域，发现在不同物种中，其序列保持不变，表明它对DNA-PKcs的功能至关重要[18]。

2 DNA-PKcs在DSB位点的募集与激活

在NHEJ修复过程中，Ku70/Ku80通过识别DSB，包围损伤DNA末端的15 bp，形成一个松散的环来启动NHEJ，Ku蛋白对DSB的识别无序列特异性[19]。Ku蛋白结合到DNA末端后，促进DNA-PKcs在DSB位点的募集，DNA-PKcs与DNA末端结合后，将Ku异二聚体向DSB末端内部推进[20-21]。当DSB上无Ku蛋白，DNA-PKcs与DSB的亲和力明显降低，仅有约20%的结合，且DNA-PKcs激酶活性很低。当DSB上有Ku蛋白存在时，DNA-PKcs被募集至DNA末端，其活性增加5～10倍[22]。

DSB末端直接与DNA-PKcs的DNA末端结构域(DNA end binding，DEB)结合。DEB结构域是由DEB附加螺旋(DEBappended helix，DEB-A)(2 724-2 730 aa)、连接体(6个氨基酸)和DEB螺旋(2 736～2 767 aa)组成[9](图2)。在脊椎动物中，Ku80包含1个C端区域(C-terminal region，CTR)和1个灵活的尾巴，对DNA-PKcs的激活发挥作用[23]。研究表明，DNA-PKcs与Ku80的C端保守序列EEGGDVDDLLDMI(720-732 aa)结合[24-25]，其中Ku80(725-731 aa)形成了1个离散的a-螺旋，与DNA-PKcs的NUC194结构域(1 815-2 202 aa)相互结合，从形成的复合体结构来看，DNA-PKcs的1 912～1 923 aa与1 955～1 970 aa之间的螺旋结构，很可能直接与Ku80 CTR结合[26]。

图2 DNA-PKcs与DNA末端结合位点示意图[9，26]

Ku异二聚体与DNA-PKcs组成DNA依赖蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)，是NHEJ修复通路的关键因子。Chaplin等[27]也发现了Ku80-CTR的类似结构特征，Ku80 CTR的尾部延伸到另一个损伤DNA末端的DNAPKcs分子中，这可能有助于两个损伤DNA末端的连接。由DNA-PKcs、Ku70/80和dsDNA组成的复合物，包含两个XRCC4同源二聚体，每个同源二聚体与一个Lig4分子结合，并通过它们的头部结构域与单个XLF同源二聚体连接，形成远程连接复合体[9]。这将有助于损伤的两个DSB末端靠近排列，形成连接复合体，促进DSB末端的连接和保护，以避免异常降解或连接，同时DNA-PKcs被激活[26]。

3 DNA-PKcs在NHEJ修复中的作用过程

激活后的DNA-PKcs能够使自身及相关修复因子磷酸化，其中ABCDE与PQR位点簇的自磷酸化对NHEJ修复发挥至关重要的作用[28]。电离辐射实验结果表明，DNA-PKcs从DSB位点释放，其半衰期约为1 h，但ABCDE与PQR位点簇中S2056突变为无法发生磷酸化的丙氨酸后，约60%的DNA-PKcs在诱导DSB后2 h，DNA-PKcs持续存在于DSB位点[29]，阻碍了连接酶对DSB的连接，抑制NHEJ修复[30]。在NHEJ修复过程中，DNA-PKcs的ABCDE与PQR位点簇，其自身构象如何变化，以及如何发挥功能，是多年来研究的热点[23，27]。

DNA-PKcs的N-HEAT与M-HEAT各形成一个开环结构，与顶部相连。而FAT-Kinase-FATC区域位于开环结构的顶部，像一个王冠[11，27](图3)。DNA-PKcs与DNA末端结合，并将Ku异源二聚体向内推进[20-21]。在激活过程中，DNA-PKcs的PI3K调节区域(PI3K-regulatory domain，PRD)旋转115度，以暴露催化结构域中底物与ATP结合凹槽。PRD结构域在ATM和ATR激酶中也发挥类似作用，是PIKKs家族的一个共同特征[31]。PRD的旋转和激酶结构域的提升，使N-HEAT和M-HEAT向催化结构域弯曲，类似于一个弯曲的膝盖，ABCDE簇自磷酸化，使DNA末端暴露，这种构象允许DNA-PKcs将DNA末端呈现给其他NHEJ修复因子。如内切酶Artemis，对DNA末端(如发夹、5′或3′悬垂、气泡和环等结构)进行适当剪切，便于末端连接，同时DNA-PKcs保护DNA末端免受其他因素损伤[15，31-32]。因此，激酶活性缺失或ABCDE的突变，会遮盖DNA末端，以阻止NHEJ进程。如纯化的DNA-PKcs未发生自磷酸化，将会阻断T4连接酶介导的末端连接[33]。ABCDE簇除了分子间的自磷酸化(通过另一个的DNA-PKcs)，还可能是分子内的自磷酸化或被ATM磷酸化。

图3 DNA-PKcs的结构和构象[11，27]

当DNA末端如发夹结构被Artemis等内切酶打开，促进DNA-PKcs的PQR位点簇自磷酸化，使DNA-PKcs被完全激活，PQR簇引入带负电荷的磷酸基团，导致DEB/DEB-A通过电荷排斥DSB末端，使DSB末端从DEB中释放，DNA-PKcs从DNA末端及Ku复合体中解离[9，17]。接下来，两个DNA末端的Ku异二聚体与连接酶复合体XRCC4-DNA Ligase IV-XLFXRCC4-DNA Ligase IV形成短程连接复合体，使DSB末端水平对齐排列，易于连接酶复合体对损伤DNA末端连接，从而修复形成完整的DNA链[26]。DNA-PKcs自磷酸化触发从远程连接复合体到短程连接复合体的转变[26]。DNA-PKcs保护DNA末端不被过早处理、连接和降解，直到两个断裂的末端被正确定位后，才从损伤DNA两端解离，释放物理空间，便于断裂的DNA末端连接[34]。在NHEJ修复过程中，DNA-PKcs的自磷酸化，DNA末端加工和连接的协调均需高度调控，相关的具体机制尚待研究[9]。

4 DNA-PKcs与疾病

4.1 DNA-PKcs与肿瘤

DNA-PKcs参与了典型的肿瘤通路，包括DNA损伤检查点调控、细胞周期控制、有丝分裂调控、微管动力学和染色体分离[35]。同时NHEJ是基因组重排的一个关键来源，并增加了细胞中恶性转化的风险[36]。DNA-PKcs在肿瘤中发挥重要作用，特别是在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、胃癌(gastric carcinoma，GC)和结肠直肠癌(colorectal cancer，CRC)中的研究比较广泛，明确了DNA-PKcs在癌症发生发展中的重要作用，有助于发现治疗靶点和新的生物标志物。

DNA-PKcs与肿瘤发生的易感性相关。在537例结直肠癌病例中有72例(13.4%)发生DNA-PKcs突变，提示DNA-PKcs与结直肠癌的发生有关联。Wang等[37]的癌症病例表明，DNAPKcs可增加胰腺癌和乳腺癌的易感性。Zheng等[38]证实了DNAPKcs在肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)细胞中过表达。除上述癌症外，也有报道称食管癌中DNA-PKcs的表达增加[39]。

此外，DNA-PKcs通过刺激血管生成，促进肿瘤细胞增殖。DNA-PKcs在RCC细胞中过度异常表达，调节mTORC2 AKT活化、HIF-2a表达，促进RCC细胞增殖[38]。DNA-PKcs的药理学或遗传抑制，也可抑制RCC细胞的增殖。据报道，DNA-PKcs在大多数GC亚型中过度表达，并且DNA-PKcs敲除可导致增殖减少和细胞周期停滞[40]。

Sun等[41]报道DNA-PKcs的表达与临床分期、淋巴浸润、远处转移和5年生存率有关。癌组织中DNA-PKcs上调，DNAPKcs高表达的患者总体生存率较低。Zhang等[42]研究显示DNAPKcs在多个乳腺癌亚型中过度表达，这与患者的低生存率相关。DNA-PKcs与GC患者低生存率相关[40]。因此，DNA-PKcs是肿瘤潜在的治疗靶点。Davidson等[43]利用DNA-PKcs的小分子抑制剂NU7026和IC486241处理，可以显著提高CRC细胞系中的疗效。

4.2 DNA-PKcs与其他疾病

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)患者大脑皮质提取物中的NHEJ水平降低，同时AD脑提取物[44]中的DNA-PKcs水平显著降低。在最近的一项研究中，亚致死水平的聚集Aβ，已被证明可以抑制PC12细胞中的DNA-PK活性，其中一个潜在的机制可能是Aβ介导的ROS，导致DNA-PKcs降解[45]。Aβ还能诱导DNA-PKcs碳基化，这是一种不可逆的蛋白氧化修饰，可能触发蛋白酶体降解[46-47]。对于其他与DNA-PKcs一样重要的NHEJ成分(如Ku，Artemis)，它们在AD中的作用仍未被阐明。

DNA-PKcs也与免疫相关。据报道显示小鼠DNA-PKcs种系突变，导致严重的联合免疫缺陷，选择体细胞突变或小分子抑制剂使DNA-PKcs激酶失活，导致DSB修复缺陷，促进基因组不稳定性[48]。另外，DNA-PKcs可通过NF-κB通路，激活黏附分子VCAM和炎症细胞因子TNF，促进先天性免疫与炎症的发生[49]。

DNA-PKcs与衰老也具有相关性。研究表明，老年小鼠比年轻小鼠的细胞中含更多的DSB，在细胞衰老过程中，基因组的完整性和DNA损伤后NHEJ的修复效率显著下降，导致与年龄相关的基因组不稳定及衰老的发生[50]。

5 结语

DNA-PKcs被认为是肿瘤进展和转移的潜在驱动因素，可作为晚期恶性肿瘤的潜在治疗靶点。目前DNA-PKcs的几种选择性小分子抑制剂Nedisertib、AZD7648、VX-984和CC-115已经进入临床阶段[47]。对NHEJ修复过程中，DNA-PKcs的结构变化、作用过程等的解析，不仅有助于研究NHEJ修复过程中的结构连接复合体，还可以靶向设计变构构象的NHEJ抑制剂，从而提高治疗的特异性和治疗潜力。此外，关于DNA-PKcs在肿瘤等疾病中的确切作用及其潜在的分子机制，目前仍不十分清楚，未来需要持续研究，以开发针对DNA-PKcs的临床转化应用。