装载siRNA的纳米阳离子脂质体在小鼠体内的药代动力学研究

问天娇，陈欣然，白 靖，郑 颖，王雅鹃，于佩佩，崔京霞

(1．河北医科大学第四医院药学部，河北 石家庄 050011；2．石药集团中奇制药技术有限公司，河北 石家庄 050035；3．河北医科大学药学院，河北省创新药物研究与安全性评价重点实验室，河北 石家庄 050017)

小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)是一类长约20～25个核苷酸的双链RNA分子，进入细胞后可诱发同源mRNA的特异性降解，导致目标基因沉默[1]。近年来RNA干扰(RNA interference，RNAi)药物在疾病治疗领域具有较好的开发潜力[2]。2018年世界上首款siRNA药物Patisiran(商品名为Onpattro，Alnylam公司)，将siRNA靶向至甲状腺素运载蛋白(transthyretin，TTR)，特异性沉默TTR的mRNA并阻断蛋白生成，获批准用于临床治疗，这是RNAi技术发展史上的重大里程碑事件之一[3-4]。

虽然多项研究成果显示出了RNAi药物在肿瘤、基因疾病等治疗上的应用前景，如Liu等[5]研究表明，siRNA能有效抑制P-糖蛋白和多药耐药蛋白7的表达，显著提升耐紫杉醇细胞对药物的敏感性，有效逆转非小细胞肺癌多药耐药性。但在体内实验中，由于siRNA分子大、稳定性差、易被血液中的核酸酶降解、难穿透细胞膜等弊端，很难到达靶位点发挥疗效，因此，如何增加药物稳定性以及如何对体内微量的siRNA进行准确检测和定量是siRNA药物药代动力学研究中的难题[6-7]。有研究报道了生物样品中siRNA的定量方法，主要包括液质联用法、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)检测法、基于杂交的酶联免疫法、液相色谱分析法和荧光分析法等[8-10]。基于SYBR GreenⅠ染料的qPCR，操作简便、灵敏度高和重现性好[11]。本团队在前期研究[12]已合成了目标siRNA序列，构建了表达质粒，并制备了该质粒的纳米隐形阳离子脂质体。本文拟进行该siRNA脂质体的化学稳定性考察，并探索siRNA及其脂质体在小鼠体内的药代动力学。

1 材料与方法

1.1 实验动物

NOD SCID小鼠12只，SPF级，雌性，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号为SYXK(京)2021-007，使用许可证号为SYXK(冀)2021-007。小鼠饲于屏障环境，温度25～27℃，湿度60%左右，维持12 h光照及12 h黑夜循环，常规标准饲料喂养，饲料购自北京科澳协力饲料有限公司。

1.2 主要试剂和仪器

DNaseⅠ购自TaKaRa公司，80%血清购自Gibco公司，qPCR相关试剂(SYBR混合物、M-MLV逆转录酶、Oligo dT)购自Invitrogen公司，表达siRNA的阳离子脂质体和裸质粒(pDual-oligo)由石药集团中奇制药技术有限公司制备。DYY-11型电脑三恒多用电泳仪，购于北京六一仪器厂，qPCR仪购于日本BIOER公司。

1.3 siRNA脂质体酶切和血清中稳定性检测

裸质粒和质粒脂质体采用课题组前期已构建的靶向肿瘤多药耐药1(multidrug resistance，MDR1)基因的siRNA表达质粒及装载了该质粒的纳米隐形阳离子脂质体[12]。

1.3.1 酶切稳定性检测取裸质粒和质粒脂质体(以质粒计)2μg，平行各设5份，其中4份分别加入2 μL DNaseⅠ(50 U/μL)，在加入DNaseⅠ后20 min、1 h、4 h、24 h时提取DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳40 min，以未加入DNaseⅠ的裸质粒及脂质体为对照，通过ImageJ软件对电泳条带进行条带灰度值测定，并计算各时间点DNA残留率，以作用时间为横坐标，siRNA质粒残留率为纵坐标作图。

1.3.2 血清中的稳定性检测取裸质粒和质粒脂质体(以质粒计)2μg，平行5份，其中4份分别加入80%血清为实验组，以未加入血清的脂质体及裸质粒为对照，按1.3.1中的方法进行后续琼脂糖凝胶电泳。

1.4 脂质体的药代动力学检测

利用qPCR方法建立siRNA质粒脂质体检测曲线，设5个浓度梯度，依次为1 000、100、10、1、0.1μg/mL，PCR反应体系(SYBR混合物12.5μL，ddH2O 8.5μL，上、下游引物各1μL，模板2μL)，变性95℃、30 s，退火56℃、25 s，延伸72℃、30 s，循环40次完成PCR实验，以siRNA脂质体浓度的常用对数(lgC)为横坐标，CT值为纵坐标作图，求得标准曲线。

将20μg siRNA裸质粒及siRNA质粒脂质体通过尾静脉注射进入小鼠体内，分别在给予受剂物后0 min、5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、12 h、24 h取血，提取血液中总RNA，按照20μL逆转录反应体系(dNTP混合物1μL、0.1 mol/L的DTT 2 μL、50μmol/L的Oligo dT 1μL、5×RT反应缓冲液4μL、500 ng/μL的模板2μL、M-MLV逆转录酶1 μL、RNase out核酸酶抑制剂1μL、DEPC处理水8 μL)，在PCR仪上进行逆转录反应37℃、50 min，70℃、15 min，得到反应产物cDNA。以逆转录产物cDNA为模板，设空白对照(不加模板的反应系统)，进行PCR扩增，将所得的CT值代入上述标准曲线，计算各时间点的药物浓度(以siRNA质粒计)，以时间为横坐标，药物浓度为纵坐标作图，计算药物的半衰期。

1.5 统计学方法

结果数据以±s表示，应用Origin 2019b统计软件进行数据分析和图像处理。采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA质粒脂质体化学稳定性的检测结果

2.1.1 在DNaseⅠ中的稳定性结果显示裸质粒在DNaseⅠ中仅20 min就全部降解；而质粒脂质体降解较缓慢，20 min、1 h、4 h的DNA残留率依次为(45.78±4.57)%、(34.69±5.22)%、(22.88±3.98)%，直到24 h仍有(20.16±2.47)%的残留，与裸质粒组相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)，见图1和图2。上述结果说明质粒经脂质体包裹后得到有效的保护，siRNA在体内的稳定性是其发挥药效的必要前提。

图1 裸siRNA质粒和siRNA质粒脂质体在DNaseⅠ中的稳定性(琼脂糖电泳)

图2 裸siRNA质粒和siRNA质粒脂质体在DNaseⅠ中作用不同时间的DNA残留率

2.1.2 在血清中的稳定性结果显示裸质粒在80%血清中20 min时仅残留(11.03±0.92)%，在1 h时基本全部降解；而质粒脂质体在20 min、1 h、4 h时DNA残留率依次为(40.74±1.13)%、(26.61±0.98)%、(19.85±0.82)%，24 h时仍残留(10.26±1.04)%，两组间差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图3和表1。说明质粒经脂质体包裹后得到有效的保护，可在血清中保持相对稳定。

图3 裸siRNA质粒和siRNA质粒脂质体在80%血清中的稳定性(琼脂糖电泳)

表1 裸siRNA质粒和siRNA质粒脂质体在80%血清中不同时间后的DNA残留率/%

2.2 质粒脂质体在小鼠体内的定量检测结果

qPCR对siRNA质粒脂质体药代动力学检测得到的曲线见图4。标准曲线方程为y=-3.023x+22.014，R2=0.989，表明该脂质体在0.1～1 000μg/mL范围内线性关系良好。在各时间点分别对小鼠体内裸siRNA质粒及siRNA质粒脂质体的浓度进行检测，经过计算，脂质体包裹的质粒半衰期约为2 h，而裸质粒仅为6 min，见图5。

图4 小鼠体内siRNA脂质体药代动力学检测的标准曲线

图5 siRNA质粒脂质体药代动力学检测

3 讨论

近年来，研究者对RNAi药物的研发热情较高，一些研究成果也逐渐显示出了RNAi药物在基因疾病以及肿瘤等治疗上的应用前景。但是RNAi的治疗途径尚不成熟，仍有一些障碍需要克服，包括其安全性、靶向性、递药系统、体内稳定性、定量研究等[13]。目前，为解决siRNA药物在递送时存在的稳定性问题，大多数研究均借助了载体[14]，使用最广泛的非病毒载体包括脂质体、聚合物纳米颗粒、肽、抗体和小分子等。脂质体是一种理想的药物载体，具有良好的生物相容性、非免疫原性、易于功能化等优点，已用于包括肿瘤在内的多种疾病的临床治疗[15]。对于siRNA分子的装载和运输常使用阳离子脂质体[16-17]，阳离子脂质体携带的正电荷可以中和siRNA带的负电荷，形成的复合物结构紧密，通过细胞膜的胞吞或融合作用进入细胞发挥作用，从而极大地延长循环时间，促进siRNA的递送。

siRNA药物的结构、性质等不同于化学药物，其适用的检测方法也不同。目前，已有多种方法用于生物基质中siRNA的绝对定量，对于体外化学合成修饰和体内载体表达的siRNA检测，常使用qPCR方法[18]，将siRNA反转录成cDNA，对累积的扩增产物进行定量。qPCR敏感度高、重复性好且能够特异检测出生物样品中的siRNA[19]，是应用于siRNA药物体内药代动力学评价较为理想的方法。

阳离子脂质体能够保护核酸类药物进入体内，是一种高效的递送载体，它与siRNA带的负电荷结合并将siRNA包封于内部，起到保护作用[20]。为了进一步确定阳离子脂质体作为核酸类药物载体的可靠性，对于含微量siRNA的血液样品，在提取siRNA和反转录过程中难免会造成siRNA的降解和损失。本文首先对siRNA脂质体在DNaseⅠ和血清中的稳定性进行了考察。结果提示，与裸质粒相比，siRNA表达质粒经过脂质体包封以后，在DNaseⅠ和血清中稳定性显著增加。随后的药代动力学研究结果提示经脂质体包裹siRNA在小鼠体内半衰期明显延长。

综上所述，该脂质体能够延长药物的作用时间，提高药物的生物利用度。随着纳米制剂新技术突飞猛进的发展，以脂质体为代表的纳米药物递释系统因其优越的理化性质和优异的生物相容性将受到更广泛的关注。