Cystatin 6蛋白在哈萨克族食管鳞癌组织中的表达及其意义

李子垚，张海平，买地尼也提·尼亚孜，居来提·艾尼瓦尔，张力为，伊地力斯·阿吾提，，

(1．新疆医科大学第一附属医院胸外科，新疆 乌鲁木齐 830054；2．新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054)

食管癌为全球十大恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分居全球第7位和第6位，且因高侵袭性和低存活率使其成为了最致命的癌症之一[1]。根据组织学类型可将食管癌分为鳞癌和腺癌，我国大多为食管鳞状细胞癌，且发病率逐年增加[2-3]。新疆地处伊朗至我国北中部的食管癌高危地带，食管癌的发病具有显著的种族和地域差异性，以哈萨克族人群发病率最高[4-5]。人型半胱氨酸蛋白酶抑制cystatin 6(cystatin M/E，CST6)是一种蛋白水解酶抑制剂，属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，其表达水平的高低以及活性强弱，对维持蛋白水解的平衡具有重要意义。有研究报道CST6参与多种恶性肿瘤的发生发展过程，最初被认为是乳腺癌中的新型肿瘤抑制基因[6]。在后续研究中发现，因其具有双重结合位点的特性，所以表现出促癌或抑癌两种完全不同的作用[7-8]。该基因在乳腺癌、宫颈鳞癌[9]、皮肤鳞状细胞癌[10]、黑色素瘤、肺癌、脑颈部癌、前列腺癌、胃癌和肾癌中表现出肿瘤抑制效应。有报道提出在与乳腺癌和口腔鳞癌中某些半胱氨酸组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和CSTL)的异常表达对肿瘤的生长、侵袭和转移的蛋白水解途径产生抑制效应，而被认为是一种肿瘤促进基因[11-12]。其在食管鳞癌中的表达及临床病理意义尚不明确，在食管癌高发民族哈萨克族中尚未见相关研究报道。此研究将探讨CST6在哈萨克族食管鳞癌患者癌组织及其癌旁正常组织中的表达及其临床病理意义。

1 材料与方法

1.1 患者资料

选取新疆医科大学第一附属医院胸外科2010年12月—2020年12月行食管癌根治术，并且具有随访记录的55例哈萨克族食管鳞癌患者，随访时间从患者出院开始追踪至患者死亡，按照月数纳入本研究。其中男性32例，女性23例；年龄32～74岁，平均年龄(61.64±8.46)岁。纳入标准：①术后病理证实为鳞癌；②切缘病理检查示阴性；③有明确的病理分期；④完整的随访记录。排除标准：术前接受放、化疗等其他特殊治疗。收集患者的癌组织和癌旁组织(距离癌组织5 cm以上)。组织学分类、分化程度以及术后详细病理分期根据美国癌症联合委员会第八版分期标准进行分类[13]。术后病理分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期31例，Ⅲ期15例。本研究通过了新疆医科大学第一附属医院医学伦理委员会的批准(批准文号K201911-02)，取得了所有患者及家属的知情同意。

1.2 免疫组化分析

采用免疫组织化学Envision二步法检测癌组织和癌旁组织中CST6蛋白的表达。CST6兔多克隆抗体购自美国Invitrogen公司，兔二步法检测试剂盒(PV6001)购自北京中杉金桥公司。标本经常规脱蜡、水化、去除内源性过氧化物酶、用柠檬酸抗原修复液抗原修复、滴加一抗(1：300稀释)，于4℃过夜后次日滴加二抗、DAB显色(3 min)、苏木素复染、脱水及封片。镜检采用双盲法，由2名高年资病理科医师完成，每张切片均随机观察5个高倍镜视野(×400)。阳性判定标准根据着色强度和阳性细胞比例来定：①阳性细胞的着色强度按照无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别计分为0、1、2、3分；②阳性细胞数目按照0、＞0～25%、＞25%～50%、＞50%～75%、＞75%～100%分别计分为0、1、2、3、4分。两个分数相加得到总的染色分数，0～3分定义为低表达，4～7分定义为高表达，计算阳性表达率。

1.3 统计分析

用SPSS 26.0进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料采用例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验(当理论频数＜5时，应用Fisher精确检验法)。采用Kaplan-Meier单因素法和COX多因素回归进行生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CST6蛋白的表达情况

免疫组化结果见图1。CST6蛋白的表达在哈萨克族食管鳞癌组织中主要定位于细胞质、细胞膜以及角化区(少部分细胞核中有表达)，且在同一患者的癌组织中分化程度较高的区域阳性程度更高，在癌旁组织中高表达水平仅限于分化层。55例食管鳞癌标本及其对应的癌旁组织中CST6阳性表达率分别为36.4%(20/55)和61.8%(34/55)，与癌旁正常组织比较，癌组织中CST6阳性表达率降低(P=0.036)。

图1 免疫组织化学Envision法检测CST6蛋白的表达情况

2.2 CST6蛋白表达水平与临床病理指标的关系

CST6蛋白表达与食管鳞癌患者临床病理指标的关系见表1。CST6蛋白的表达与家族史(χ2=5.595，P=0.045)和肿瘤分化程度(χ2=4.420，P=0.036)有关。CST6蛋白的表达情况在无肿瘤家族史、有食管鳞癌家族史以及非食管鳞癌家族史这3组患者中的表达有明显差异，无肿瘤家族史患者其CST6蛋白的表达程度更高；在肿瘤高分化患者中蛋白的表达水平高于低/中分化患者。与性别、年龄、吸烟史、饮酒史、神经脉管侵犯、浸润深度、淋巴结转移以及术后病理分期等临床病理因素无明显相关(均为P＞0.05)。

表1 CST6的蛋白表达与食管鳞癌患者临床病理指标的关系

2.3 食管鳞癌患者的生存率与CST6蛋白表达水平的相关性分析

Kaplan-Meier生存率的分析结果显示，CST6高表达患者的平均生存时间为50.6个月，而低表达患者为22.3个月。两组患者的生存曲线见图2，CST6蛋白的表达水平与患者生存率有关(χ2=0.032，P=0.003)。食管癌患者预后影响的单因素分析结果见表2，可见CST6蛋白的表达水平、浸润深度以及术后病理分期与食管鳞癌患者的预后相关(P＜0.05)。

表2 食管癌患者预后影响的单因素分析

图2 食管鳞癌患者的生存曲线

食管癌患者预后影响的多因素分析结果见表3。把单因素分析中有意义的因素，结合本课题组以往研究结果所认为的影响预后的相关因素一起，进一步纳入到COX多因素生存分析中，结果显示，CST6蛋白阴性表达、有淋巴结转移和肿瘤低分化程度是食管鳞癌患者不良预后的独立危险因素(P＜0.05)。

表3 食管癌患者预后影响的多因素分析

3 讨论

食管癌的发生发展是多种基因及蛋白参与并相互作用的分子生物学过程。当肿瘤抑制基因变异时，细胞分裂变快，稳定性遭破坏，细胞增生调控紊乱，克隆生长加快，直至肿瘤形成[14-15]。CST6在皮肤鳞状细胞癌中表现为肿瘤抑制效应，Boman[16]的研究认为皮肤上皮组织受到刺激最终导致皮肤癌变(皮肤鳞癌)的发生。借此我们将食管鳞癌的发生发展与其在物理层面上食管黏膜受到“刺激”后其上皮组织会表达多种与先天免疫系统相关的蛋白相关联。CST6是进化相关的半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员，对溶酶体半胱氨酸蛋白酶有特异性抑制作用[17]。半胱氨酸蛋白酶在体外参与结缔组织和基底膜组分的降解，机体因为这些蛋白酶的异常表达以及活性的改变而发生肿瘤侵袭[18-21]。当过量的CST6与参与肿瘤生长、迁徙、侵袭和转移相关的半胱氨酸组织蛋白酶(如组织蛋白酶B)相作用，CST6的表达保护了机体其他具有免疫功能相关的蛋白，平衡细胞的增殖和凋亡，发挥了其在非食管癌患者中的特定保护作用[22]。当蛋白水解功能失衡，有癌变倾向的细胞不能被及时清除，食管癌变可能就此发生。CST6基因的抑癌作用除了可以用蛋白水解酶的平衡性来解释外，Lalmanach等[23]的研究发现人工合成的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(E-64)对细胞增殖和内皮黏附无显著影响，因此CST6可能通过抑制组织蛋白酶以外的其他机制或者是通过调控基因转录发挥肿瘤抑制作用。CST6在脑胶质瘤和原发性脑肿瘤中被鉴定为甲基化敏感基因[24-25]，因此CST6的甲基化可能使该基因发生表观沉默从而促使肿瘤的发生，借此我们推测食管鳞癌的发生也可能与CST6基因的表观修饰

有关。

本研究结果显示，食管鳞癌组织CST6蛋白的表达水平低于癌旁组织，阳性表达率分别为36.4%和61.8%，差异具有统计学意义(P=0.036)，与Zeeuwen等[22]的研究结果相一致。此外，无肿瘤家族史的患者CST6蛋白表达明显高于有肿瘤家族史的患者，同时CST6的阳性表达率具有随着肿瘤分化程度的增高而升高的趋势，与家族史(P=0.045)和肿瘤分化程度(P=0.036)相关。食管癌变极早期阶段已发生细胞凋亡，凋亡细胞主要位于增生活跃的基底细胞群中，而本实验免疫组化的结果显示在癌旁组织中食管上皮的分化层细胞CST6蛋白的阳性表达高于基底层细胞，所以CST6可能不能作为极早期食管鳞癌的生物学检测指标，为此我们进一步探索CST6表达与食管鳞癌预后的关系。在生存率的分析中CST6阳性表达的患者平均生存时间高于阴性表达的患者，差异具有统计学意义(P=0.003)。而单因素及多因素分析结果均提示食管鳞癌组织中CST6蛋白的低表达是其不良预后的独立危险因素。

综上所述，CST6蛋白低表达可能是哈萨克族食管鳞癌患者中的肿瘤危险因素，与其发生、发展及不良预后相关，且可能成为在预后判断中具有重要意义的生物标志物之一。我们拟扩大样本量，并增加与汉族的对照样本，继续对其在不同民族样本中的组织表达水平进行临床病理学分析，并进一步对CST6基因表观遗传学变异及其在食管鳞癌不良预后的调控分子机制层面进行深入研究，为食管鳞癌患者的诊断、治疗以及预后发掘出新的视角。