大孔吸附树脂分离纯化红禾麻总黄酮工艺的优化

孙开芬， 陈胤睿， 徐文芬， 舒燕霞， 石兴雨

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

红禾麻为荨麻科艾麻属植物珠芽艾麻Laporteabulbifera(Sieb. et Zucc.) Wedd.的新鲜或干燥全草，功效祛风除湿、活血化瘀、止痛、止痒，为贵州地方标准收载的少数民族苗族习用药材，常鲜用以酒泡服，对类风湿性关节炎有较好的疗效[1-4]，有着抗炎镇痛[5-9]、抗风湿[10-12]、降脂[13]等作用，课题组前期研究表明，其提取物具有抗炎、抗氧化活性[14-15]。随着对红禾麻化学成分和药理作用研究的不断深入，发现黄酮是该药材主要成分，而且对类风湿性关节炎具有较好的疗效。

目前，大孔吸附树脂以适用范围广、吸附量大、解析条件柔和、选择性强、易于再生、成本低等优点[16]，被广泛应用于中药及民族药中黄酮、生物碱、萜类、皂苷等常规的分离纯化[17-22]，但目前尚无关于红禾麻总黄酮的相关研究。因此，本实验优化大孔吸附树脂分离纯化红禾麻总黄酮工艺，以期为该成分药理活性深入研究、相关新药开发、相关制剂绿色制造奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 UV-1800型紫外分光光度仪(日本岛津公司)；AG135电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；FA3204B电子分析天平(上海天美天平仪器有限公司)；R-215型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；BS-1E振荡和旋转培养箱(常州市华普达教学仪器有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FN101-2A型电热恒温鼓风干燥箱(长沙仪器仪表厂)。

1.2 试剂与药物 红禾麻采自贵州省雷山县，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为荨麻科艾麻属植物珠芽艾麻Laporteabulbifera(Sieb. et Zucc.) Wedd.的地上部分。芦丁对照品(批号100080-201610，纯度92.6%，中国食品药品检定研究院)。HP20、HPD300、HPD722型大孔吸附树脂(郑州和成新材料科技有限公司)；D101、AB-8型大孔吸附树脂(上海蓝季科技发展有限公司)。结晶氯化铝(批号20170926，天津市科密欧化学试剂有限公司)。乙醇为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)；水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定 参考文献[23]报道。

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品8.20 mg，置于25 mL量瓶中，70%乙醇溶解，制成质量浓度为0.303 7 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2 显色反应液制备 称取结晶氯化铝(AlCl3·6H2O)适量，加水溶解，定容至50 mL量瓶中，制成10% AlCl3溶液，即得。

2.1.3 线性关系考察 精密吸取对照品溶液 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，置于10 mL量瓶中，加入10% AlCl3溶液2 mL，蒸馏水定容至刻度，摇匀，40 ℃水浴显色反应30 min，取出，摇匀，以相应试剂为空白，在406 nm波长处测定吸光度。以对照品质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)进行回归，得方程为A=27.3X-0.004 5(r=0.999 7)，在9.111～24.30 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.1.4 浸膏制备 称取2.0 kg药材粉末，30倍量70%乙醇回流提取1 h，滤过，滤渣用20倍量70%乙醇再回流提取1 h，滤过，合并滤液，旋转蒸发仪回收溶剂得到稠浸膏，水浴蒸干，即得(共0.6 kg)。

2.1.5 测定方法 精密称取浸膏1.5 g，50 mL蒸馏水超声溶解至无明显颗粒，摇匀，精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，按“2.1.3”项下方法加入显色试剂，蒸馏水定容至刻度，40 ℃水浴显色反应30 min，取出，摇匀，以相应试剂为空白，测定总黄酮含量，结果为2.111 mg/mL。

2.1.6 精密度试验 取对照品溶液0.8 mL，置于10 mL量瓶中，按“2.1.3”项下方法显色，在406 nm波长处测定吸光度6次，测得其RSD为1.21%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取浸膏1.5 g，50 mL蒸馏水超声溶解至无明显颗粒，平行6份，按“2.1.3”项下方法显色，在406 nm波长处测定吸光度，测得其RSD为1.78%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 精密称取浸膏1.5 g，50 mL蒸馏水超声溶解至无明显颗粒，按“2.1.3”项下方法显色，于0、2、4、6、12、24、48 h在406 nm波长处测定吸光度，测得其RSD为2.11%，表明溶液在48 h内稳定性良好。

2.1.9 加样回收率试验 取总黄酮含量已知的浸膏液6份，每份1 mL，分别按1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入对照品溶液，按“2.1.3”项下方法显色，在406 nm波长处测定吸光度，计算回收率。结果，总黄酮平均加样回收率为99.81%，RSD为0.98%。

2.2 树脂预处理 取D101、AB-8、HPD300、HP20、HPD722树脂适量，在95%乙醇中浸泡24 h使其充分溶胀，取出装柱，95%乙醇以最大体积流量冲洗，蒸馏水以同样体积流量冲洗至无醇味，收集洗净树脂，滤去水，备用。

2.3 静态吸附研究

2.3.1 树脂筛选 称取预处理后抽滤至干的5种树脂各3 g，平行3份，置于100 mL锥形瓶中。取浸膏1.5 g，加入50 mL蒸馏水，超声溶解至无明显颗粒，加入装有树脂的锥形瓶中，置于恒温振荡箱(25 ℃，120 r/min)中振荡24 h，滤过，取续滤液，计算树脂对总黄酮的吸附率、比吸附量，公式分别为吸附率=[(C0V0-C1V1)/C0V0]×100%、比吸附量=(C0V0-C1V1)/M(C0为吸附前总黄酮初始质量浓度，V0为吸附前上样液体积，C1为吸附后总黄酮质量浓度，V1为吸附后溶液体积，C2为解吸后总黄酮质量浓度，V2为解吸后溶液体积，M为树脂质量)。将吸附饱和的树脂用适量水冲洗，滤干，置于100 mL锥形瓶中，加入70%乙醇50 mL，置于恒温振荡箱中振荡24 h，进行静态解吸，计算树脂对总黄酮的解吸率、比吸附量，公式分别为解吸率=[C2V2/(C0V0-C1V1)]×100%、比解吸量=C2V2/M，结果见表1。由此可知，D101型树脂对总黄酮的吸附率、比吸附量、解吸率、比解吸量最高，故选择其用于总黄酮富集纯化。

2.3.2 静态吸附曲线绘制 取预处理后抽滤至干的D101型树脂约3 g，精密称定，共14份，置于100 mL锥形瓶中，取浸膏1.5 g，50 mL蒸馏水超声溶解至无明显颗粒，加入装有树脂的锥形瓶中，置于恒温振荡箱(25 ℃、120 r/min)中振荡，于30、60、90、120、180、240、300、360、460、660、860、1 060、1 260、1 440 min各取出1个锥形瓶，测定总黄酮质量浓度，绘制静态吸附曲线，见图1。由此可知，树脂吸附过程发生了3个阶段变化，并在360 min后逐渐达到平衡：第一阶段，吸附能力在前120 min内呈线性快速上升趋势；第二阶段，在120～360 min时吸附能力增加较缓慢；第三阶段，在360 min后树脂达到吸附平衡。

图1 D101型树脂静态吸附曲线

2.4 动态吸附研究

2.4.1 泄露曲线绘制 取预处理后的D101型树脂约10 g(湿质量，柱床体积约19 mL)，精密称定，湿法缓慢装入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，取浸膏6.0 g，加入200 mL蒸馏水超声溶解至无明显颗粒，以1.0 mL/min体积流量上样，每10 mL收集1份流出液，测定406 nm波长处吸光度，计算总黄酮质量浓度，绘制泄露曲线，当流出液中该成分质量浓度为上样液的1/10时，可认为达到泄露点[24]，结果见图2。总黄酮初始质量浓度为2.111 mg/mL，在第5份流出液中为0.233 4 mg/mL，即已达到泄露点，故选择上样体积为50 mL。

图2 总黄酮在D101型树脂上的泄露曲线

2.4.2 上样液质量浓度对动态吸附性能的影响 精密称取预处理好的D101型树脂6份，每份10 g(湿质量，柱床体积约为19 mL)，湿法缓慢装入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，取浸膏0.4、0.7、1.0、1.2、1.5、2.0 g，超声溶解于50 mL蒸馏水中，以1.0 mL/min体积流量上样，动态吸附4 h后，加入3 BV(1 BV=19 mL)蒸馏水于吸附柱中进行水洗，收集未吸附液与水洗液，测定406 nm波长处吸光度，计算总黄酮吸附率、比吸附量，结果见图3。由此可知，总黄酮吸附率随着上样液质量浓度增加而降低，而比吸附量恰好相反；当其质量浓度达到2.111 mg/mL后，相同时间动态吸附使其吸附率趋于平衡状态。由于上样液质量浓度太低不足以使树脂吸附饱和，而太高又会浪费浸膏和试剂，最终确定其质量浓度不超过2.200 mg/mL，浸膏质量约为1.5 g。

图3 不同上样液质量浓度下总黄酮吸附率、比吸附量

2.4.3 上样体积流量对动态吸附性能的影响 取预处理后的D101型树脂约10 g(湿质量，柱床体积约19 mL)，精密称定，共4份，湿法缓慢装入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，取浸膏1.5 g，置于50 mL蒸馏水中，超声溶解至无明显颗粒，分别以1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min体积流量上样，动态吸附4 h后加入3 BV蒸馏水于吸附柱中，对树脂进行水洗，收集未吸附液与水洗液，测定406 nm波长处吸光度，计算上样液质量浓度吸附率，结果见图4。由此可知，上样体积流量为1 mL/min 时，会造成树脂柱堵塞，不利于吸附(提取液中富含多糖而较黏稠)；为4 mL/min时，树脂柱不易堵塞，而且增加了动态吸附次数，使吸附率最高，达87.25%。最终确定，上样体积流量为4 mL/min。

图4 不同上样体积流量下总黄酮吸附率

2.4.4 径高比对动态吸附性能的影响 取预处理后的D101型树脂约7、10、12、15 g(湿质量，柱床体积约13、19、22、27 mL)，精密称定，共4份，湿法缓慢装入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，径高比分别为1∶5、1∶7、1∶8、1∶10，取浸膏1.5 g，置于50 mL蒸馏水中，超声溶解至无明显颗粒，以4.0 mL/min体积流量通过树脂柱，动态吸附4 h后加入3 BV蒸馏水，对树脂进行水洗，收集未吸附液与水洗液，测定406 nm波长处吸光度，计算总黄酮吸附率、比吸附量。结果，不同径高比下总黄酮吸附率分别为76.64%、85.56%、88.44%、90.87%，比吸附量分别为11.560、9.031、7.779、6.395 mg/g，即径高比为1∶5时虽然比吸附量最大，但吸附率最低，吸附不完全，而随着径高比增加比吸附量逐渐减小，说明径高比越小，对浸膏和试剂浪费越多；径高比越大，树脂吸附越不饱和，对树脂浪费越多。最终确定，径高比为1∶7。

2.4.5 水洗用量对树脂动态解吸率的影响 取预处理后的D101型树脂约10 g(湿质量，柱床体积约19 mL)，精密称定，共5份，湿法缓慢装入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，径高比为1∶7，取浸膏1.5 g至50 mL蒸馏水中，超声处理至无明显颗粒，以4.0 mL/min体积流量通过树脂柱，动态吸附4 h后分别加入3、6、9、12、15 BV蒸馏水洗脱，收集水洗液，测定406 nm波长处吸光度，计算总黄酮含量，结果见图5。由此可知，水洗用量为3～9 BV时，总黄酮含量平稳；为9～12 BV时，其含量明显升高，但继续加大时可能会对已被树脂吸附的该成分造成一定损失。最终确定，水洗用量为9 BV。

图5 不同水洗用量下总黄酮含量

2.4.6 洗脱剂体积分数对总黄酮洗脱量的影响 取预处理后的 D101型树脂约10 g(湿质量，柱床体积约19 mL)，精密称定，湿法缓慢装入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，径高比为1∶7，取浸膏1.5 g，置于50 mL蒸馏水中，超声溶解至无明显颗粒，以4 mL/min体积流量上样，动态吸附4 h后加入9 BV蒸馏水除杂，依次用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇及无水乙醇各3 BV梯度洗脱，分段收集洗脱液，测定406 nm波长处吸光度，计算总黄酮洗脱量，结果见图6。由此可知，5%乙醇就可逐渐洗脱总黄酮，30%、40%乙醇能将大部分该成分洗脱出来，80%、90%、无水乙醇几乎洗脱不出。综合考虑对总黄酮的最大富集效果及对溶剂的绿色节约，最终确定洗脱剂(乙醇)体积分数为70%。

图6 不同体积分数洗脱剂下总黄酮洗脱量

2.4.7 洗脱剂用量对总黄酮洗脱效果的影响 取预处理后的D101型树脂约10 g(湿质量，柱床体积约19 mL)，精密称定，共5份，湿法缓慢装入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，径高比为1∶7，取浸膏1.5 g，溶于50 mL蒸馏水中，将2.111 mg/mL总黄酮溶液以4 mL/min体积流量上样，动态吸附4 h后用9 BV蒸馏水除杂，再分别用3、6、9、12、15 BV 70%乙醇以1 mL/min体积流量洗脱，收集洗脱液，测定406 nm波长处吸光度，计算洗脱率。结果，不同洗脱剂用量下洗脱率分别为82.49%、87.34%、91.78%、97.65%、97.57%，即总黄酮洗脱效果随着洗脱剂用量增加而逐渐加强，当其用量为12 BV时达到平衡。最终确定，洗脱剂(70%乙醇)用量为12 BV。

2.4.8 洗脱剂体积流量对总黄酮洗脱效果的影响 取预处理后的D101型树脂约10 g(湿质量，柱床体积约19 mL)，精密称定，共4份，湿法缓慢装入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，径高比为1∶7，取浸膏1.5 g溶于50 mL蒸馏水中，以4 mL/min体积流量上样，动态吸附4 h后，9 BV蒸馏水除杂，再用12 BV 70%乙醇以1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min体积流量洗脱，收集洗脱液，测定406 nm波长处吸光度，计算洗脱率。结果，不同洗脱剂体积流量下洗脱率分别为87.04%、84.51%、79.43%、75.38%，即总黄酮洗脱率随着洗脱剂体积流量增加而降低，为3、4 mL/min时，不利于洗脱溶液与总黄酮之间的相互作用，而且时间较短，导致洗脱率较低；为1 mL/min时，延长了洗脱剂与总黄酮的作用时间，从而洗脱率最高。最终确定，洗脱剂体积流量为1 mL/min。

2.4.9 验证试验 根据上述单因素试验，确定最优工艺为D101型树脂10 g，浸膏质量1.5 g(总黄酮质量浓度约为2.111 mg/mL)，上柱体积50 mL，上样体积流量 4 mL/min，径高比1∶7，洗脱时先以9 BV蒸馏水除杂，再用12 BV 70%乙醇洗脱，洗脱体积流量为1 mL/min。称取5份预处理后的D101型树脂，每份约10 g(湿质量，柱床体积约19 mL)，精密称定，湿法缓慢装入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，径高比为1∶7，吸取2.111 mg/mL总黄酮溶液50 mL，以4 mL/min体积流量上样，待吸附饱和后用9 BV蒸馏水除杂，再用12 BV 70%乙醇以1.0 mL/min体积流量洗脱，收集洗脱液，计算总黄酮洗脱量、洗脱率，结果见表2。由此可知，优化工艺对总黄酮具有较好的分离富集效果，D101型树脂可大大提高该成分纯度。

表2 验证试验结果(n=5)

3 讨论

本实验考察5种大孔吸附树脂对红禾麻总黄酮的吸附、解吸性能，发现非极性树脂(HPD300、HP20、D101型)吸附率、解吸率高于弱极性树脂(AB-8、HPD722型)。再通过静态吸附解析实验发现，D101型大孔吸附树脂的效果最好，故选择其进行单因素试验。

黄酮为红禾麻活性成分，具有抗炎、抗氧化活性[15]，但不同批次之间该成分含量差异较大，仅以其为指标评价药材品质过于片面，故本实验选择总黄酮作为研究对象。前期预实验考察了体积流量5 mL/min对总黄酮含量的影响，发现上样液黏稠，即使将吸附柱控制阀调至完全也不能得到该数值，最高仅接近于4 mL/min，故本实验只考察了1、2、3、4 mL/min。验证试验结果显示，红禾麻总黄酮质量分数从7.04%升至23.89%，固形物含量由1.50 g减少至0.38 g，表明大孔吸附树脂纯化工艺合理可行，可用于后期相关研究。