苏木4种提取物对脱矿牙釉质的再矿化作用

李茹芳， 崔 霞， 王丽梅， 李秋艳， 蓝 海*

(1.大理大学药学院，云南 大理 671000；2.云南省大理州人民医院口腔科，云南 大理 671000)

苏木为豆科云实属植物苏木CaesalpiniasappanL.的干燥心材，最早记载于《唐本草》中，味甘、咸，性温，具有松弛筋络、活血散结、镇静止痛等功效[1]，主要分布在广东、广西、云南等地，其中广西是主要的生产及栽培区。目前，国内外学者已从苏木中分离出近100个化合物，主要包括苏木素类、原苏木素类、高异黄酮类等[2-3]。近年来，对苏木提取物活性的研究主要集中在抗肿瘤[4-5]和免疫抑制[6]。课题组前期研究证实，苏木乙醇、乙酸乙酯、正丁醇以及水提取物可以抑制变形链球菌和粘性放线菌的生长，但还没有文献报道苏木是否有再矿化的作用。本实验建立体外龋齿模型，通过给予前期实验所得最低抑菌浓度(MIC)，研究苏木4种提取物对牛切牙脱矿牙釉质再矿化的影响，初探苏木的防龋机制。

1 材料

1.1 试剂与药物 新鲜牛切牙(大理泰兴市场)。氟化钠(分析纯，上海申博化工有限公司)；磷酸二氢钾(分析纯，天津市化学试剂研究所)；冰乙酸、氯化钾(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)；HEPES缓冲液(美国Sigma公司)。

1.2 仪器 Leica TCS SP8型激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司)；BK-POLR-透反射偏光显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)；CP224C型电子天平[奥豪斯仪器(上海)有限公司]；YMP-2B型金相试样磨抛机(苏州欧卡精密光学仪器有限公司)；78HW-1型恒温磁力搅拌器(江苏金坛市亿通电子有限公司)；DHP-9162型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；SB-25-12DT型超声清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 釉质样品制备

2.1.1 牙釉质制备 参考文献[7]报道，取新鲜牛牙，去除软组织，用硬组织切片机分离牙冠和牙根，采用磨抛机将牙冠表面抛光成光滑平面(开窗区为5 mm×5 mm)，超声清洗30 min，去离子水洗净，置于0.9% 氯化钠溶液中，4 ℃下保存备用。

2.1.2 分组 在显微镜下观察牙釉质样品，选取无裂痕、龋损、氟斑的完好牙釉质，用去离子水洗净晾干，随机分为脱矿组、阴性组、阳性组(20 mg/mL 氟化钠)及苏木乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物组，每组6颗(实验组用药浓度为课题组前期实验所得的变形链球菌MIC值2.5 mg/mL)。

2.2 脱矿和再矿化实验 将釉质样品全部浸入脱矿液[8](50 mmol/L乙酸、2.2 mmol/L磷酸二氢钾溶液、2.2 mmol/L二水合氯化钙溶液、0.5 mol/L碳酸氢钠溶液，pH 4.5)中，置于37 ℃摇床中100 r/min脱矿72 h，用去离子水冲洗，形成人工龋齿。将人工脱矿后的釉质样品在各实验组溶液中浸泡5 min，去离子水冲洗干净，滤纸吸干水分，放入酸性缓冲液[8](50 mmol/L乙酸、2.25 mmol/L二水合氯化钙溶液、0.5 mol/L碳酸氢钠溶液、1.5 mmol/L磷酸二氢钾溶液、130 mmol/L氯化钾溶液，pH 5.0)中浸泡30 min，去离子水冲洗干净，滤纸吸干水分，最后放入中性缓冲液[8](20 mmol/L HEPES缓冲液、2.25 mmol/L二水合氯化钙、1.5 mmol/L磷酸二氢钾溶液、130 mmol/L 氯化钠溶液，pH 7.0)中浸泡10 min，去离子水冲洗干净，滤纸吸干水分。每天重复6次，持续10 d，进行再矿化，其余时间在中性缓冲液中过夜，试剂每天更换[9]。

2.3 偏光显微镜观察 参考文献[10]报道，将经过脱矿和再矿化之后的牙釉质样品进行包埋处理，在稳定的水流下，沿着釉质样品开窗区的中央用硬组织切割机将其纵向切割成薄片，为完整的平面，切片为110 μm，每组取6片，样品用甘油封片后在偏光显微镜下观察并拍照。

2.4 激光扫描共聚焦显微镜观察 按照“2.3”项下方法将牙釉质切割成110 μm薄片，每组6片，用0.1 mmol/L罗丹明B荧光染料染色1 h，蒸馏水冲洗多余染料，干燥后用甘油密封，并将其置于激光扫描共聚焦显微镜下，在529 nm激发波长下扫描，10倍镜下观察罗丹明B的渗入量[11]。用Image J v1.8.0软件将扫描的图像进行处理分析，并以荧光面积(单位为μm2)、总荧光量、平均荧光量3个参数表示[12]。

3 结果

3.1 偏光显微镜观察 脱矿组和阴性组釉质样品表面有许多病理损伤区域，形成不规则的表面缺陷，釉质层黑色区域明显，存在以脱矿为主的正性双折射区(红色箭头所示)。进行pH循环后，阳性组和苏木4种提取物组釉质层相对完整，表面轻度脱钙，脱矿区病变深度变浅(红色箭头所示)，并且龋损部位出现负性双折射的再矿化带(白色箭头所示)，见图1。

图1 偏光显微镜观察各组釉质龋再矿化作用

3.2 激光扫描共聚焦显微镜观察 脱矿后红色荧光强度较强，红色条带荧光面积较大；进行pH循环后，阳性组和苏木4种提取物处理后的牙釉质荧光强度较弱，红色条带较细、短，红色条带荧光面积较小，见图2。

图2 激光扫描共聚焦显微镜观察各组釉质龋再矿化作用

3.3 苏木4种提取物对牙釉质再矿化后激光扫描共聚焦显微镜参数的影响 如表1所示，与脱矿组比较，苏木4种提取物组总荧光量、平均荧光量均减弱(P<0.05)。与阴性组比较，苏木乙酸乙酯、正丁醇、水提取物总荧光量均降低(P<0.05)，苏木正丁醇、水提取物组平均荧光量均降低(P<0.05)。苏木各提取物再矿化作用生成的晶体使荧光染料进入牙组织脱矿釉质微孔中的量减少，龋损程度降低，具有再矿化作用。

4 讨论

由于口腔环境结构的复杂多变，牙齿硬组织脱矿受多种因素影响。早期龋的自然形成时间一般为0.5～1.5年，因此无法直接在口腔内研究龋损的形成和再矿化机制。为了研究龋病的发生机制和预防措施，从20世纪50年代起人工龋实验已被广泛用于观察和分析龋病的发生、发展和修复过程[13]。

表1 苏木4种提取物对牙釉质再矿化后激光扫描共聚焦显微镜测量参数

人工龋的主要方法有体外法，包括化学龋法、电化学法、细菌产酸龋法和人工口腔模型。本实验采用的化学致龋法是目前人工龋模型中最常用的方法，其优点是可以在控制变量的条件下研究单个因素的影响，从而得到牙齿硬组织表层和表层下脱矿及再矿化动力学变化的信息[14-15]。

偏光显微镜是研究牙体硬组织晶体结构的基本方法，通过偏振光的折射反映出釉质中具有双折射特性的矿物质，可用于定性观察脱矿和再矿化过程中晶体结构的变化[16]。本实验发现，脱矿组和阴性组的釉质样品因大量脱矿，龋损严重，呈现正性双折射的暗带，而样品经过苏木各提取物处理后，龋损厚度明显变浅，密度变小并呈现负性双折射的再矿化带，表明苏木各提取物均有抑制脱矿和促进再矿化的作用。

激光共聚焦显微镜是目前观察牙齿硬组织脱矿和再矿化的一种先进方法，是生物学、医学研究中最常用的荧光显微工具之一，已经成为新的实验手段，它解决了一些以往研究中存在的技术难题，创造更好的条件，在口腔硬组织定性和定量研究方面有很大的应用价值[17]。通过激光共聚焦显微镜测得龋损区域的荧光面积，总荧光量及平均荧光量可以了解标本脱矿及再矿化情况。牙釉质自身无法发荧光，需要使用罗丹明B等染料染色，经过激光共聚焦显微镜照射可发射荧光，然后利用Image J软件进行定量分析。荧光染料分子可以渗进脱矿牙釉质的微孔中，脱矿区域的脱矿情况和总荧光量、平均荧光量成正比。实验中荧光条带代表脱矿部分，通过计算荧光条带的总荧光量和平均荧光量，分析再矿化的效果[18]。本研究结果显示，脱矿后红色荧光强度较强，红色条带荧光面积较大；氟化钠和苏木各提取物处理后的牙片荧光强度较暗，红色条带较细、短，红色条带荧光面积较小，进一步说明苏木提取物有促进牙釉质再矿化作用，从而达到防龋的效果。

综上所述，苏木作为一种抑菌杀菌能力强、对牙组织有再矿化效果的天然药物，具有良好的应用前景和药用价值。