白蚀丸中7种潜在肝毒性成分含量测定及用药安全分析

贾夏丽， 熊 芬， 熊爱珍,2 *， 杨 莉,2， 王峥涛,2

(1.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，上海市复方中药重点实验室，上海 201203；2.上海中药标准化研究中心，上海 201203)

白蚀丸收录于2020年版《中国药典》，由盐补骨脂、制何首乌、灵芝等14味中药组成, 是治疗白癜风的常用药物。近年来，由白蚀丸导致的不良反应甚至肝脏衰竭时有发生，国家药品监督管理局在第9期《药品不良反应信息通报》中明确指出白蚀丸可致肝损害，其用药安全性备受关注。白蚀丸组方中的制何首乌、补骨脂、黄药子、紫草均具潜在肝毒性。何首乌中二苯乙烯苷长期大量使用会造成肝损伤[1]；大黄素对人正常肝细胞具有明显损伤作用[2]；大黄素甲醚代谢产物可抑制尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶诱导肝毒性[3]；补骨脂中的补骨脂素和异补骨脂素可影响胆汁酸代谢诱导胆汁淤积[4]；黄独素B可下调多药耐药相关蛋白2[5]，并引起活性氧的积累诱导线粒体依赖性凋亡[6]；紫草中含多种吡咯里西啶生物碱, 该生物碱是毒性最强的植物性肝毒物质之一，可导致肝窦阻塞综合征等临床疾病[7]。2020年版《中国药典》以补骨脂素和异补骨脂素作为白蚀丸的含量测定指标[8]；有文献对白蚀丸中二苯乙烯苷和丹皮酚进行含量测定[9]，但对其他成分尚未有研究。因此，本研究利用UPLC-MS、HPLC等技术对白蚀丸中具潜在肝毒性的化学成分进行定性、定量检测，为其临床用药安全提供参考。

1 材料

1260 Infinity高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，配备紫外检测器；超高效液相-Micromass ZQ2000单四极杆液质联用仪，配备电喷雾离子源，单四级杆质谱检测器及超高效液相-Xevo G2-XS高分辨液质联用仪(美国沃特世公司)，配备电喷雾离子源，Q-TOF四级杆-飞行时间质谱检测器; BSA124S万分之一天平、BT25S十万分之一天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-250DB超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);AdvantageA10超纯水仪 (美国Millipore公司)。

二苯乙烯苷(批号N1103AS)、大黄素(批号J0610AS)、大黄素甲醚(批号MB6587)、黄独素B(批号M0305AS)、补骨脂素(批号O0927AS)和异补骨脂素(批号O1002AS)对照品购自大连美仑生物技术有限公司，纯度大于98%；千里光碱对照品(批号PRF10071724)购自成都普瑞法科技开发有限公司，纯度均大于98%。甲酸铵购自美国Sigma-Aldrich公司；甲醇和乙腈购自美国Fisher公司；磷酸、无水乙醇、甲酸购自国药集团化学试剂有限公司。水为超纯水，由Milli-Q超纯水仪制备。不同批次的白蚀丸购自广东和陕西，190201和190202购自广东，Y00003和Z00002购自陕西。

2 方法

2.1 白蚀丸中二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚的含量测定 参考《中国药典》制何首乌含量测定项下方法进行[8]。Agilent ZQRBAX SB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱温30 ℃；体积流量1 mL/min；进样量10 μL。二苯乙烯苷以乙腈-水(25∶75)为流动相，检测波长为320 nm。大黄素和大黄素甲醚以甲醇-0.1%磷酸(80∶20)为流动相，检测波长为254 nm。

2.2 白蚀丸中补骨脂素、异补骨脂素、黄独素B的含量测定 参考文献[10-11]进行。色谱条件为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；流动相含2 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸(A)和乙腈(B)，梯度洗脱(0～2 min, 5%～15% B；2～3 min, 15%～25% B; 3～6 min, 25%～50% B; 6～10.5 min, 50%～95% B；12～14 min, 5% B)；柱温45 ℃；体积流量0.4 mL/min；进样量2 μL。质谱条件为正离子模式下进行选择离子监测；离子监控通道m/z187.1(补骨脂素和异补骨脂素),m/z362.1(黄独素B)；毛细管电压3.0 kV；锥孔电压40 V；离子源温度120 ℃；脱溶剂温度400 ℃；锥孔气(N2)体积流量50 L/h；脱溶剂气(N2)体积流量800 L/h。

2.3 白蚀丸中吡咯里西啶生物碱的分析 参考课题组前期报道方法[12-13]，利用超高效液相-Xevo G2-XS高分辨液质联用仪对不同类型吡咯里西啶生物碱的特征离子进行全扫，对白蚀丸中的吡咯里西啶生物碱进行快速筛选和鉴定。色谱条件为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；流动相含10 mmol/L甲酸铵的0.1%氨水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱(0～5 min, 5%～20% B; 5～7 min, 20%～40% B; 7～8.5 min, 40%～90% B; 10～12 min, 5% B)；柱温45 ℃；体积流量0.4 mL/min；进样量10 μL。质谱条件为正离子扫描模式下全扫；离子扫描范围m/z50～800；碰撞能范围30～35 V；毛细管电压3.0 kV；锥孔电压40 V；离子源温度120 ℃；脱溶剂温度350 ℃；锥孔气(N2)50 L/h；脱溶剂气(N2)800 L/h。

参考文献方法[13]，利用超高效液相-Micromass ZQ2000单四极杆液质联用仪进行选择离子监测，以千里光碱为对照品建立标准曲线对白蚀丸中吡咯里西啶生物碱进行半定量分析。选择离子为m/z336.2(千里光碱)、m/z398.2(hydroxymyoscoripine)，其余色谱及质谱条件与吡咯里西啶生物碱快速筛选条件相同。

2.4 对照品溶液的制备 分别精密称定补骨脂素、异补骨脂素、黄独素B、大黄素、大黄素甲醚对照品2.25、1.49、2.50、5.00、5.00 mg于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度配制成质量浓度分别为450、298、500、1 000、1 000 μg/mL对照品储备液。加甲醇分别稀释成一系列梯度的对照品工作液。

精密称定二苯乙烯苷对照品2.50 mg于2.5 mL量瓶中，用稀乙醇配成质量浓度为1 000 μg/mL的对照品储备液。加稀乙醇稀释成一系列梯度的对照品工作液。

精密称定千里光碱对照品1.00 mg于10 mL量瓶中，加0.1%甲酸至刻度配置成质量浓度为100 μg/mL对照品贮备液。加0.1%甲酸稀释成一系列梯度的对照品工作液。

2.5 供试品溶液的制备 白蚀丸中二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚含量测定为取白蚀丸50 g，打粉，过四号筛。取本品粉末约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，取出，放冷，再称定质量；加甲醇补足减失的质量，摇匀，静置滤过。取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

白蚀丸中补骨脂素、异补骨脂素、黄独素B含量测定为取本品粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入100 mL 75%甲醇，称定质量；超声处理40 min，取出，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置滤过。取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

白蚀丸中吡咯里西啶生物碱检测为取本品粉末约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加30 mL 0.5%甲酸超声40 min，离心取上清，药渣再加30 mL 0.5%甲酸超声处理40 min，离心取上清，合并2次提取液，加氨水碱化至pH为10左右，加入二氯甲烷萃取5次，每次50 mL，室温静置分层后分离二氯甲烷层，合并二氯甲烷层，旋转蒸发至干，称定提取物质量，加 0.1%甲酸适量制成质量浓度为2 mg/mL溶液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

3 结果

3.1 白蚀丸中吡咯里西啶生物碱的快速筛选 不同类型吡咯里西啶生物碱在二级质谱裂解时可产生不同的特征离子, 如retronecine型吡咯里西啶生物碱可产生m/z120和m/z138的特征碎片。千里光碱为retronecine型吡咯里西啶生物碱，其对照品保留时间为6.3 min (图1A), 分子离子峰为m/z336.179 4(C18H26NO5+)(图1B)且二级谱图中可见明显m/z120和m/z138特征碎片(图1C)，与文献报道[12-13]相符。在白蚀丸样本中，检测到一个可产生这两个特征离子的化合物,其保留时间为6.7 min(图1D)，分子离子峰为m/z398.217 6(图1E)，二级谱图中可见明显m/z120和m/z138特征碎片(图1F)，初步判定其为retronecine型吡咯里西啶生物碱。进一步根据高分辨质谱数据分析其分子离子峰和二级碎片的元素组成，推断其质谱裂解途径(图2), 并与文献[14]比对，鉴定其为hydroxymyoscoripine。

图1 白蚀丸样本中吡咯里西啶生物碱质谱图

图2 Hydroxymyoscoripine的二级质谱裂解途径

3.2 白蚀丸中潜在毒性成分的含量分析 白蚀丸样本中hydroxymyoscoripine含量测定根据课题组前期建立方法利用UPLC-MS进行(图1), 大黄素、大黄素甲醚和二苯乙烯苷含量测定参照药典方法利用HPLC进行(图3)，补骨脂素、异补骨脂素、黄独素B含量测定参考文献方法利用UPLC-MS进行(图4)。对于方法的线性、灵敏度、稳定性、重复性等进行考察，均符合含量测定要求。各化合物在白蚀丸样本中的含量见表1。所有化合物中含量最高的是二苯乙烯苷，最高为10.1 mg/g，其次为异补骨脂素、补骨脂素。同一个厂家的样品各化合物的含量差异较小，但不同厂家的各化合物的含量差异较大。

1.二苯乙烯苷 2.大黄素 3.大黄素甲醚注：A为二苯乙烯苷对照品色谱图(320 nm)，B为大黄素对照品色谱图(254 nm)，C为 大黄素甲醚对照品色谱图(254 nm)，D为白蚀丸样品中的二苯乙烯苷色谱图(320 nm)，E为白蚀丸样品中的大黄素色谱图(254 nm)，F为白蚀丸样品中的大黄素甲醚色谱图 (254 nm)。

1.补骨脂素 2.异补骨脂素 3.黄独素B注：A为补骨脂素、异补骨脂素对照品色谱图(m/z 187.1)，B为黄独素B对照品色谱图(m/z 362.1)，C为白蚀丸样品中的补骨脂素、异补骨脂素色谱图(m/z 187.1)，D为白蚀丸样品的黄独素B色谱图(m/z 362.1)。

3.3 白蚀丸致临床肝损伤事件回顾与分析 回顾白蚀丸致肝损伤的临床报道(表2), 患者服用白蚀丸均用于治疗白癜风，无其他病史。患者每日服用白蚀丸的剂量和频次都遵循说明书，即3次/日，2.5 g/次，但服用时间较长，最短20 d，最长时间达108 d。中毒症状包括肝功能障碍、瘙痒、乏力、纳差、神志不清等；住院后停止服用白蚀丸，并经治疗1周至1月后病状消失恢复正常。

4 讨论

2020年版《中国药典》以补骨脂素和异补骨脂素作为白蚀丸的含量测定指标成分，规定二者的含量之和不少于2.5 mg/g[8]。本研究首次对白蚀丸中7种潜在肝毒性成分进行分析。检测本实验中不同批次白蚀丸，补骨脂素和异补骨脂素的含量之和为3.4～4.0 mg/g, 符合药典规定。不同批次白蚀丸样本中各化合物的含量差异较大(RSD为10%～58%)。根据结果，计算服用白蚀丸复方时摄入毒性成分的含量, 见表3。

含吡咯里西啶生物碱的植物及制品的安全性问题已引起国际性相关部门的广泛注意，许多国家或组织都制定了相应的法规。其中以德国卫生部门的标准最为严格，规定每日摄入草药制品中吡咯里西啶生物碱的量不得超过1 mg，长期服用(超过6个月)时则不得超过0.1 mg，外用不得超过10 mg，孕妇及哺乳期妇女不得使用[15]。尽管没有关于hydroxymyoscoripine的毒性数据，但其为retronecine型吡咯里西啶生物碱，属于肝毒性最强的类型[16]；每日服用白蚀丸摄入hydroxymyoscoripine的量为3 mg，为德国卫生部门规定的3倍,存在着一定的用药风险。此外，白蚀丸含多种潜在毒性成分，结合白蚀丸致临床肝损伤病例报道，白蚀丸致肝损伤可能的原因有患者长期服用白蚀丸摄入多种毒性成分，通过影响药物代谢酶增加人体对毒性成分的易感性；患者长期服用白蚀丸，造成相关毒性成分在体内蓄积致毒；多种毒性成分共同作用于机体多条信号通路，产生了类似协同增毒的效果，使得毒性增强。因此，在今后的研究中，应加强对白蚀丸中潜在毒性成分的研究，采用基于整体动物模型的毒效与毒代动力学相结合的研究模式，明确其安全窗口，建立更加科学合理的质量标准，以全面系统地评价其安全性，指导临床合理用药。

表1 白蚀丸中7种潜在肝毒性成分的含量(μg/g, n=3)

表2 白蚀丸致肝毒性病例回顾

表3 白蚀丸中潜在毒性成分致毒剂量及临床患者摄入量