分子印迹技术在四环素类抗生素处理中的应用进展

马煜萱，李靖，许愿，郭冀峰

(长安大学 水利与环境学院 旱区水文与生态效应教育部重点实验室，陕西 西安 710054)

四环素是一类广谱抗生素的统称，其中包括四环素、金霉素、土霉素、半环素、甲环素、替加环素等[1]。自1940年四环素被发现以来，被广泛应用到兽医学、医学、畜牧业等方面[2]。据研究报道，超过70%的四环素会通过人类和动物的粪便尿液排入环境中，最终造成地表水和地下水的污染[3]。此外，过量的四环素会抑制水生生物的生长，促进抗生素耐药性细菌的生长，对人类健康和环境造成严重威胁。四环素的降解和检测对于净化水体，保护生态环境具有重要意义。然而，环境中残留的四环素通常具有低浓度、高污染、基质复杂等特点。如何快速的选择性的识别并检测四环素成为降解四环素的重要环节。

分子印迹是一种具有特异性，选择性识别目标分子的新型技术，其最大的特点是特异性识别污染物。因此利用分子印迹技术去除和监测复杂环境和食品中的痕量污染物受到了广泛的关注。2004年Cai等[4]首次将四环素作为模板分子合成印迹聚合物，用于选择性吸附四环素。2018年，Mohsenzadeh等[5]总结了分子印迹聚合物在测定牛奶中抗生素的应用；2020年，王莉燕[6]课题组综述了分子印迹聚合物在抗生素残留测定中的应用。目前还未有关于分子印迹技术处理四环素类抗生素的综述，本文系统总结了近年来分子印迹技术在处理食品和废水中的四环素的应用进展，包括分子印迹固相萃取技术和分子印迹传感器提取和监测食品中的四环素，以及分子印迹与光催化、膜分离技术结合处理废水中四环素。

1 分子印迹技术在提取和检测食品中四环素的应用

1.1 分子印迹固相萃取技术

四环素因抗菌性好、实用性强、价格低廉被广泛运用到畜牧业和兽医学中，然而，四环素的过量使用会导致动物源性食品存在残留的微量四环素，对人类健康产生极大威胁。目前应用最多的检测方法为高效液相色谱法(HPLC)。但大多数食物样品中的四环素浓度较低且样品基质成分复杂，检测其残留四环素前必须经过提纯预处理，固相萃取是最常见的样品预处理技术。但固相萃取技术容易受到杂质干扰，且有机溶剂消耗量大，选择性低。将分子印迹技术与固相萃取技术结合，以印迹聚合物作为萃取吸附剂，相比与传统固相萃取法，具有可选择性高、识别性强、结果灵敏准确等优点。目前，国内外已有利用分子印迹聚合物作为固相萃取剂的许多研究性报道。Wang等[7]合成了一种新型混合模板分子印迹聚合物，建立了基质固相分散法同时提取猪肉中的4类四环素类药物，并进行超高效液相色谱测定。该方法对猪肉中四环素的检出限在0.5～3.0 ng/g之间，可作为一种快速、简便、特异、灵敏的肉类中药物残留的多组分检测方法。Xu等[8]以牛血清白蛋白(BSA)和多巴胺为双功能单体制备了新型磁性分子印迹纳米材料，将印迹纳米材料作为固相吸附剂，与高效液相色谱相结合，选择性地从未处理的牛奶样品中提取并测定痕量四环素。四环素类药物的回收率在84.1%～95.8%之间，相对标准差<6.7%。Feng等[9]以四环素为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体合成了分子印迹聚合物。制备的固相萃取柱能同时捕获4个四环素，吸附能力高(3 560～4 700 ng)，回收率高(>87%)，检出限在20～40 ng/g范围内，强化空白样品(牛奶、鸡蛋和猪肉)的回收率在74%～93%范围内。He[10]以氧化石墨烯(GO)和碳纳米管(CNT)的三维碳纳米复合物合成了选择性高的亲水性四环素印迹聚合物，以该聚合物作为吸附剂固相萃取食品中的TC残留物，然后通过高效液相色谱(HPLC)检测。在最佳条件下，该方法的检出限(MDL)为0.127 μg/kg。该方法的提取效率是在三个真实样品(牛奶、鸡肉和鱼类)中进行的，这些样品中掺入了3个水平(5，10，20 μg/kg)的四环素。结果显示回收率分别为(85.58±0.19)%～(116.87±8.92)%(S/N=3)。Ma等[11]将二甲胺四环素分子印迹纳米聚合物聚合在金属有机骨架材料表面，合成一种新型复合材料。以该化合物为吸附剂，建立了分散固相微萃取鸡肉中7种四环素的超高效液相色谱测定方法。该复合材料对7种四环素具有较高的吸收能力(2 200～3 000 ng/mg)和高回收率(>92%)，可重复使用8次。7种药物的检出限为0.2～0.6 ng/g，该方法可作为肉类中四环素残留量多重检测的实用工具。

1.2 分子印迹传感器

传统检测四环素的方法有：高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用、毛细管电泳、酶联免疫吸附实验等[12-15]。传统方法虽然检测效果好，但存在耗时长、仪器昂贵、操作复杂、样品需预处理等缺点。因此亟待开发一种操作简单、方便、选择性高的方法检测四环素。分子印迹传感器的出现很好地解决了传统检测方法选择性差的问题，受到了国内外许多研究人员的青睐。分子印迹传感器可分为两大类：光学传感器和电化学传感器。其中光学传感器包括光子晶体传感器和荧光传感器。分子印迹光子晶体传感器是一种快速、简单、可视化识别目标污染物的传感器；荧光传感器由于具有检测步骤简单、灵敏度高等优良特性，被广泛应用于TC的检测。电化学传感器与光学传感器相比，检测范围更广。

1.2.1 分子印迹电化学传感器检测四环素 电化学传感器是通过将分析物与电极表面受体之间相互作用产生的化学信息转化为可分析测量的信号来对目标分子进行定量分析的一类传感器。目前，分子印迹电化学传感器的一个发展趋势为将MIPs与纳米颗粒结合修饰电极，增强分析物识别能力和传质效率，从而提高传感器的灵敏度。常见的纳米材料有：石墨烯、碳纳米管、AuNPs等。Devkota等[16]以分子印迹过氧化聚吡啶(MIOPPy)修饰的丝网印刷碳电极(SPCE)和金纳米颗粒(AuNPs)为基底，研制了一种检测四环素(TC)的选择性、灵敏度高的电化学传感器。在优化条件下，校准曲线呈1～20 mol/dm3的线性趋势，检出限为0.65 mol/dm3。该传感器成功地用于测定真实食品样品中的TC，回收率为63%，高于90%，与LC-MS法相当。Bougrini等[17]基于分子印迹聚合物和金属有机骨架修饰的金电极制备了电化学传感器。该传感器的线性范围为2.24×10-13～2.24×10-8mol/dm3，检测限低至2.2×10-16mol/dm3。该方法成功地用于蜂蜜中四环素的测定。四环素的回收率为101.8%～106.0%，RSD为8.3%。目前，一种新兴材料二维COF材料在开发快速、方便、高导电性材料方面有着广阔的前景。高度有序的多孔结构和金属活性位点的存在使得制备的二维COF具有良好的导电性和电催化活性，从而提高了所构建传感器的灵敏度。Ma等[18]以o-PD为功能单体，TC为分子模板，在COF修饰电极表面电聚合制备分子印迹电化学传感器。该传感器在5×10-13～6×10-12mol/dm3的浓度范围内与四环素呈良好的线性关系，检出限为2.3×10-13mol/dm3。为四环素在食品中的检测提供了一个经济、灵敏、特异性强的可行平台。

1.2.2 分子印迹荧光传感器检测四环素 荧光传感器是一种可以将被检测物质的浓度转化为荧光信号的传感器材料，具有灵敏度高、操作简单、检测速度快等优点，在抗生素检测尤其是四环素检测中越来越受欢迎。分子印迹荧光传感器不仅具有荧光分析的高灵敏度，同时也具有MIPs的高选择性。以量子点作为荧光材料制备分子印迹传感器较为常见。TC不存在时，量子点和印迹聚合物的电子在接受紫外光子时从价带被激发到导带，随后被激发的电子回到价带，产生荧光信号。相反，若TC存在，TC的羟基与量子点的氨基之间存在氢键作用，强相互作用使得量子点与TC之间的电子发生转移，量子点的能量会转移到QD/MIP和TC的复合物上，导致其荧光猝灭，不产生荧光信号。通过量子点的荧光变化(猝灭或增强)对四环素浓度进行定量估计。与传统量子点相比，碳量子点具有安全无毒、荧光效果好、稳定性强等优点，因此越来越多地被应用于食品中四环素的检测。Zhou等[19]通过结合分子印迹聚合物(MIPs)和石墨烯量子点(GQDs)开发了一种新型荧光传感器，在最佳条件下，其线性范围为 1.0～104μg/L 和检出限确定为1 μg/L。GQDs-MIP也表现出对TC的高选择性。荧光传感器成功应用于实际牛奶中TC的检测。Wang等[20]成功制备了SiO2-AF@MIPs荧光表面印迹传感器检测四环素，SiO2-AF@MIPs传感器表现出较高的灵敏度(LOD低至4.26 ×10-9mol/dm3)、快速检测率、可重复使用性能和较好选择性。Wei等[21]制备了一种新型碳量子点分子印迹荧光传感器用来检测四环素，其线性范围为1.0～60 mol/L，检出限为 0.17 mol/L。这种新型荧光传感器可以成功地用于实际样品中四环素的检测。为四环素在复杂环境中的选择性识别和快速检测提供了一种新思路。Hou等[22]将印迹聚合物接枝到碳量子点表面，采用微波辅助制备荧光印迹复合材料检测牛奶中的四环素，随着四环素浓度从2×10-8mol/dm3增加到 1.4×10-5mol/dm3，复合材料的相对荧光强度呈线性下降。其检出限为5.48×10-9mol/dm3。Li等[23]制备了嵌入碳点(HMIP@CD)的单孔空心分子印迹聚合物，用于检测蜂蜜中的TC，该传感器在10～200 μg/L 表现出一个优秀的线性关系，检出限低至3.1 μg/L。在TC的3个峰值水平下，回收率93%～105%，准确度低于1.6%。该方法为利用荧光干扰检测复杂基质中分析物提供了一种有效的方法。

1.2.3 分子印迹光子晶体传感器检测四环素 光子晶体是一类遵循布拉格衍射定律的具有周期性结构的光子纳米材料。分子印迹光子晶体(MIPC)传感器是一种结合光子晶体和分子印迹的传感器，在利用MIPC检测四环素时，分子印迹光子晶体因膨胀或收缩改变了其颗粒间距，最终导致衍射峰波长和颜色发生周期性的变化[24]。通过观察Debye衍射环在单色激光照射下直径的变化来检测MIPC在TC水溶液中的响应性能。 Wang等[25]采用TC作为印迹模板，成功制备了具有特定结合位点的MIPCH传感器。随着TC浓度从0增加到60 mol/L，MIPC传感器的结构颜色由蓝变红。此外，该传感器也可实现对牛奶中TC的检测，随着牛奶样品中TC药浓度的增加，MIPC传感器的颗粒间距增大约92 nm，MIPC的结构颜色由蓝色变为绿色变为橙色。然而，MIPC因湿润性差可能会导致四环素富集，从而影响检测效果。Hou等[26]通过将MIP-PC比色传感器与富集工艺相结合，制备了具有亲水-疏水模式的高灵敏度比色传感器，以提高四环素检测的灵敏度。该MIP-PC比色传感器可以实现大于200 nm的由青色到红色的比色转换，此外，通过将探测区域(MIP-PC dot)的直径从1.35 mm改变为2.79 mm，该传感器的探测范围可以从1×10-8～6×10-8m改变为1×10-8～1.5×10-7m。将10个小滴浓缩成直径为 1.35 mm 的MIP-PC点，其检测极限可降至2×10-9m。Han等[27]制备了一种用于食品中四环素检测的二维分子印迹光子晶体(MIPC)传感器。以聚苯乙烯二维光子晶体(2D-pcs)为模板，四环素为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用热聚合法制备了MIPCs。利用所制备的MIPC传感器通过德拜衍射环的视觉变化来检测四环素(TC)。该传感器响应时间 <10 min。在5次循环使用后仍保持较高的灵敏度，在猪肉和牛奶样品中TC的回收率分别为 88.4% 和91.0%，也可用于猪肉和牛奶样品中TC残留的分析。

2 分子印迹技术在废水中四环素的应用

2.1 分子印迹光催化技术

光催化技术由于其具有高效性、化学稳定性、绿色性等优点已经被广泛运用于降解环境中残量的抗生素[28-30]。在光催化过程中，污染物首先吸附在催化剂表面的活性位点上，催化剂在可见光的照射下产生强氧化性的自由基，将抗生素氧化降解[31]。然而在实际处理过程中，废水中污染物成分复杂，四环素通常是以痕量形式存在，催化剂中的主要活性物质在降解污染物时并不具有选择性，因此很难在处理痕量和混合污染物时具有良好的效果。印迹催化复合材料相较于单一催化材料，不但可以提高催化剂的特异识别能力，同时印迹聚合物可为催化剂提供活性位点，增强其降解效率。

Sun等[32]制备了一种分子印迹Ag/Ag3VO4/g-C3N4光催化剂(MIP)，具有良好的特异性识别能力和光催化活性，MIP的k值最高(0.017 94 min-1)，比原始CN、Ag3VO4、Ag/Ag3VO4/CN和NIP分别高 6.62，1.80，1.12和1.30倍。Du等[33]以四环素(TC)为分子模板，合成了一种简单、可循环利用的印迹催化复合材料ZnO@NH2-UiO-66(ZUM)，在可见光照射下，ZUM在30 min内可降解61.9%的四环素。Lu[34]采用光聚合方法和表面印迹技术合成了环保型MFA型异质结印迹光催化剂(PPy@CdS@MFA印迹)，PPy@CdS@MFA印迹光催化剂对四环素的降解率(77.59%)是环丙沙星印迹光催化剂(34.57%)的2倍多，PPy@CdS@MFA印迹光催化剂相对于CdS、CdS@MFA和非印迹光催化剂的选择性系数(k)分别为0.71，1.79和1.69。Peng[35]采用微波聚合和表面印迹技术合成了磁性粉煤灰表面印迹无金属异质结光催化剂PGM-SIP，PGM-SIP的SBET高达 43.050 2 m2/g。PGM-SIP相对于g-C3N4@MFA、PPy@g-C3N4@MFA和非印迹光催化剂的选择性系数分别为1.587，1.756和2.580。Lu等[36]采用微波聚合和表面印迹技术合成了Z型 ZnFe2O4/Ag/PEDOT，Z型ZnFe2O4/Ag/PEDOT的光降解率为71.77%，分别是ZnFe2O4、Ag/PEDOT、非印迹ZnFe2O4/Ag/PEDOT的4.74，1.42和1.31倍。

2.2 分子印迹膜

在众多分离污染物的技术中，膜分离是一种成本低、污染小、分离效果好的去除污染物的技术。分子印迹膜是由分子印迹聚合物合成的膜，通过在膜上形成特殊的记忆位点来提高膜的选择渗透性。目前，通过对有机基底膜改性例如添加无机纳米颗粒：TiO2，SiO2，Ag+，活性炭纳米颗粒等合成印迹膜分离废水中的四环素获得了很好的分离效果。Xing等[37]将多层纳米复合材料(Ag/pDA)整合到多孔膜结构中。以四环素(TC)为模板分子，制备分子印迹纳米复合膜。吸附量达到15.99 mg/g，选择通透性性能(ρ)=2∶4。微生物降解实验结果也表明 S-MINMs 具有良好的生物降解性。Wu等[38]制备双膜基分子印迹纳米复合膜(DLMIMs)。以二氧化硅和活性炭纳米颗粒作为载体合成第一个印迹层，通过相变过程后，采用溶胶凝胶聚合法制备第二层TC印迹层。获得了良好的再结合能力(115.5 mg/g)和选择性分离系数(>6.5)。Wu等[39]将多层纳米复合材料(Ag/pDA)整合到多孔膜结构中。以四环素(TC)为模板分子，通过原位光启动TRP法制备分子印迹纳米复合膜。大大提高了TC的再结合能力(35.41 mg/g)，吸附选择性和结构稳定性在10次循环操作后仍保持最大吸附能力(92.1%)。

3 结论与展望

四环素的滥用会导致其在环境和食品中富集，对人类的健康带来潜在威胁。在处理四环素的过程中，分子印迹技术展现出巨大的应用价值。将分子印迹与膜分离、光催化技术结合可大大提高废水中四环素的分离和降解效率。此外，与传统检测方法相比，分子印迹传感器可实现食品中四环素的快速、高效检测。分子印迹技术的出现虽然对提取和检测四环素提供了很大的便利，但同时也存在一些问题，例如：分子印迹膜中印迹位点的引入可能会对膜通量造成影响；分子印迹荧光传感器的荧光团的寿命较短，无法实现长期检测。但分子印迹作为一种新兴技术，具有独特优异的性能，在未来仍有巨大的发展潜质。将分子印迹技术与更多新材料(纳米材料)、新技术(固相微萃取、基质固相分散萃取)结合，有助于未来实现更加高效、绿色、环保的四环素分析检测。