乙酰转移酶p300及其对自噬分子调控机制的研究进展

曹雪丽综述，张 红审校

0 引 言

自噬是一种进化上保守的代谢途径，通过将错误折叠的蛋白质、无用或损坏的细胞器和细胞质成分运输到溶酶体系统进行降解,降解后的分子可以被循环利用，对维持细胞内稳态至关重要。自噬有大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬，在这里所说的自噬为大自噬，通常可分为不同的阶段:起始阶段,自噬小体的成核,自噬体膜的扩张和延伸,自噬小体与溶酶体融合,自噬体内容物的降解，并将降解的分子排出到细胞质中。自噬被认为是细胞程序性死亡的第二种形式，不同于凋亡[1]，是细胞在不同的营养可用性时期恢复能量平衡的一种基本能力。自噬作为一把“双刃剑”，其水平的控制性增加有助于提高细胞的生存能力;然而，过度激活自噬可通过过度破坏细胞内物质而诱导细胞自噬性死亡[2]。这一过程与多种疾病有关，包括癌症、溶酶体疾病、肌肉营养不良、神经退行性变和炎症性疾病。研究发现，在缺血缺氧诱导的H9c2细胞损伤的模型中，过表达沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)基因通过增强自噬及抗凋亡从而发挥细胞保护作用[3]。也有研究发现，在无创动脉夹夹闭腹主动脉上、下端诱导的大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型中，自噬被过度激活造成脊髓中的神经元细胞损伤，而给予脂氧素A4后，细胞自噬被抑制，使脊髓组织中微管相关轻链蛋白3B(Microtublue-associated protein light chain 3B，LC3B)阳性细胞减少，LC3-II/ LC3-I明显下降，从而缓解脊髓缺血再灌注损伤[4]。因此，如何通过调节自噬来发挥其积极的作用，减少或避免其不良的影响，是目前关注和研究的焦点。本文就乙酰转移酶p300对自噬的分子调控机制作一综述。

1 乙酰转移酶p300

乙酰转移酶p300的基因位于第二十二号染色体的q13区域，由2414个氨基酸组成，是一种能与腺病毒癌蛋白相互作用的分子量为300kDa的蛋白质，主要分布在细胞核内，可在穿梭蛋白BAT3的调控下于细胞核和细胞质之间穿梭。在哺乳动物细胞中，乙酰转移酶(histone acetyltransferases ，HAT)家族包括三个亚家族:GNAT、MYST和p300/CBP蛋白[5]。p300是一种经典的内源性HAT，在生物体中高度保守，参与DNA损伤修复和细胞周期调控等多种生理过程，与人类多种疾病的发病机制有关[6]。主要包括以下几个保守结构域：PHD结构域、溴结构域(Bd)、HAT区以及RING结构域，这些结构域相对独立具有各自的功能，又相互协调共同实现蛋白活性整体调控，其中，HAT区是其乙酰化底物蛋白的核心区域。其主要生物学功能分别为：①p300作为转录激活因子，将转录因子募集到靶基因的启动子区域，从而促进转录[7]；②作为乙酰化酶，乙酰化非组蛋白转录因子，从而增强其活性；③通过乙酰化组蛋白的N端起到HAT的作用，这种修饰引起染色质结构开放并促进转录；④乙酰化自噬相关蛋白从而抑制自噬的发生。

p300的活化直接依赖于转录因子配体的活化和寡聚化状态，转录因子二聚化使p300在高度保守且本质上无序的富含赖氨酸的自抑制环中实现反式自乙酰化，从而引起p300的激活[8]。p300的活性受到一系列细胞内和细胞外刺激的调控，是细胞内中间代谢产物乙酰辅酶A(Acetyl-coenzyme A ，Ac-CoA)的感受器，能响应来自主要的稳态传感器腺苷酸活化蛋白激酶 (AMP-activated protein kinase，AMPK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)的信号从而影响自噬的发生，受mTORC1正向调控，Unc-51类自噬激活激酶1 (Unc-51 like autophagy activating kinase 1， ULK1)和AMPK的负向调控[9-10]。Ac-CoA不仅为p300的底物，同时也为p300自身提供乙酰基，促进p300的自我乙酰化从而激活p300。热量限制可通过降低细胞Ac-CoA水平间接抑制p300活性[11]。p300在1834丝氨酸残基上的磷酸化对其组蛋白乙酰转移酶和转录活性至关重要[12]，而组蛋白3(Histone 3，H3)是p300的重要底物，其赖氨酸残基可被p300直接乙酰化[13]，因此p-p300和乙酰化的H3(Ac-H3)水平都是评估p300活性的重要指标。p300的特异性抑制剂C646是一种可逆的、可穿透细胞的吡唑啉酮基抑制剂，可与Ac-CoA竞争HAT的Lys-CoA结合位点。N-(4-氯-3-三氟甲基-苯基)-2-乙氧基-苯甲酰胺[N(4-chloro-3-trifluoromethyl-phenyl)-2-ethoxybenzamide，CTB]是p300的特异性促进剂，CTB分子与关键氨基酸残基Tyr1467和Trp1436形成强烈的分子间相互作用，从CTB分子的构象上来看，其在活性位点上是高度稳定的，并通过活化机制促进了p300 HAT的乙酰化过程[14]。

1.1p300作为转录激活因子转录激活因子是与启动子DNA上的特定位点结合并通过与其他蛋白质相互作用而增加特定基因转录的蛋白质[15]。p300是调节细胞周期和炎症基因表达的转录共激活因子[16]，同时也是一种组蛋白HAT，通常被招募到转录增强子中，通过乙酰化染色质调节基因表达，可与许多启动子结合的转录因子如CREB、核激素受体和癌蛋白相关激活因子如c-Fos、c-Jun和c-Myb相互作用，直接或通过辅助因子刺激特定基因的转录。p300/CBP和去乙酰化酶活性调节增强子的动态活性，p300/CBP催化乙酰化促进PIC组装和RNA PII募集，BRD4作为p300/CBP下游效应体促进RNA PII暂停释放，RNA PII招募和暂停释放的耦合使增强子的快速激活成为可能[17]。此外，p300/CBP的HAT功能与体内转录之间的联系被证明是由启动子连接的HAT结构域激活，而HAT受损的突变体则显示出乙酰化能力与该转录活性直接相关。在小鼠哮喘病模型中，肺组织中哮喘易感基因ORMDL3表达升高，p300活性升高，招募到ORMDL3启动子的p300和Ac-H3的数量增加，二者结合在ORMDL3的启动子区域，p300激活ORMDL3启动子的转录，使内源性ORMDL3 mRNA水平升高，当p300的HAT活性丧失时，ORMDL3启动子活性降低，C646抑制哮喘小鼠p300表达，降低HAT活性、Ac-H3水平和ORMDL3表达，缓解气道的高应激反应和改善气道重塑[18]。

1.2p300的表观遗传修饰作用表观遗传修饰是通过改变基因转录过程而不改变基因序列来影响基因功能，包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、RNA相关沉默。组蛋白乙酰化是最常见的表观遗传修饰之一，组蛋白N端乙酰化调节DNA转录，并参与基因表达的调控[19]，具有相同DNA序列的老鼠可能有不同的毛色和体重,这就是表观遗传学领域的内容。p300作为表观遗传调控因子，通过将Ac-CoA上的乙酰基转移到组蛋白基本N端尾部区域内某些赖氨酸侧链的ε-氨基上发挥酶功能[20]，能催化H3第27位赖氨酸(H3K27)乙酰化形成活化形式的H3K27ac[21-22]，因此H3K27ac是一种基因表达活跃的表观遗传标记。组蛋白上赖氨酸的乙酰化是高度动态的，由组蛋白HATs和去乙酰酶(KDAC，HDACs)共同调控[23]。p300使H3在赖氨酸56位点上乙酰化，既可以中和赖氨酸的碱性,使染色质的结构更加松散,通用转录机器更易穿过核小体组成的点阵结合到启动子区域, 同时也可以招募各类能识别乙酰化赖氨酸的转录因子,从而激活邻近基因的表达；而HDACs能催化去除H3赖氨酸残基上的乙酰基，使赖氨酸恢复到带正电的水平，带正电的H3会与带负电荷的DNA结合更加紧密，从而稳定染色质的结构，使DNA不具有可接近性，不利于基因转录，从而沉默基因表达，所以去乙酰化酶通常是一个转录抑制因子[24]。据报道，除组蛋白，p300/CBP可乙酰化许多非组蛋白：p53、GATA-1、c-Myb[6]和自噬相关蛋白。

1.3p300抑制剂的作用近几年的研究发现，抑制p300的药理学作用在多种疾病模型中有一定的治疗作用，如肿瘤、衰老、神经系统疾病、糖尿病肾病及炎症性疾病等。在神经系统疾病中，抑制p300/CBP是一种纠正自噬-溶酶体通路功能障碍和阻止tau蛋白病变的新方法[25]。去乙酰化酶在体外能直接结合p300 HAT域有效抑制其活性，改变人类、小鼠和果蝇细胞中与衰老相关的几个表观遗传标记[26]。Ac-CoA是中枢代谢的交叉点，是组蛋白乙酰转移酶调控基因表达的底物。在许多组织中，禁食或延长寿命的热量限制通过ATP-柠檬酸裂解酶降低葡萄糖衍生的代谢通量，以降低细胞质Ac-CoA水平，从而降低p300 HAT的活性，刺激长寿自噬[27]。C646通过抑制NLRP3炎性小体活性在DSS诱导的小鼠结肠炎中发挥抗炎作用，可减轻LPS诱导的小鼠急性全身炎症反应综合征[28]。在小鼠的糖尿病肾病模型中，p300激活，活性氧(reactive oxygen species，ROS)、H3k27ac、炎症因子和细胞外基质蛋白的产生增多，用C646治疗后，H3K27ac 和ROS平显著降低，并且C646对p300的长期药理抑制对血浆葡萄糖水平和体重无影响，因此p300的抑制剂治疗是糖尿病肾病的一个有前景的支持性治疗选择[29]。同样的有研究发现，在棕榈酸诱导的2型糖尿病细胞模型中，C646激活自噬通量部分逆转了肌管中萎缩相关的形态学和分子变化[30]。姜黄素是目前已知的唯一具有p300特异性的体内外天然抑制剂，且具有细胞通透性，与p300/CBP的特异性结合引起构象变化，使组蛋白H3、H4和Ac-CoA的结合效率降低[31]。鼠尾草酚是一种新型的天然p300特异性抑制剂，不仅通过与Ac-CoA竞争HAT催化结构域而特异性抑制p300 HAT活性，而且通过生成ROS促进其蛋白酶体降解，具有治疗侵袭性乳腺癌的潜力[32]。顺铂治疗可增加肾脏中p300表达和p300相关组蛋白H3赖氨酸18、27和9位点上的乙酰化，p300的另一种抑制剂藤黄醇，通过抑制氧化应激、炎症和肾小管细胞死亡保护顺铂诱导的小鼠急性肾损伤，可明显逆转p300的上调和H3的乙酰化[33]。

2 乙酰转移酶p300对自噬的分子调控机制

自噬是由一系列高度调控的信号事件控制的动态的途径，发生在所有细胞的基础水平上，并由细胞生存信号通路调控和细胞应激诱导[34]。自噬刺激可通过细胞应激和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)抑制来实现，而抑制可以通过上游的ULK1、Beclin1(又称为Atg6)和液泡分选蛋白34 (vacuolar protein sorting 34，VPS34)抑制剂以及下游自噬小体与溶酶体融合位点的多个靶点来实现。近年来研究发现，p300是一种主要的内源性自噬抑制因子[35]。

2.1通过mTORC1-p300途径调节自噬自噬主要由两个关键的信号通路调控: mTOR依赖的机制靶标通路和mTOR非依赖的通路[36]。mTOR可分为两种在功能上和生化上不同的复合物mTORC1和mTORC2，mTORC1作为自噬的主要调节器之一，其机制靶点在响应营养和能量水平下整合生长和代谢相关信号，通过ULK1、自噬相关蛋白13 (autopahgy related protein 13，ATG13)、转录因子EB等自噬相关蛋白的磷酸化来负调控自噬的发生[37]，而mTORC2则调控细胞骨架结构和细胞存活[38]。研究发现，稳态传感器mTORC1作为p300的直接激活剂，能在溶酶体表面和细胞核内与p300相互作用，可磷酸化p300的C端4个丝氨酸残基，解除其分子内RING结构域对酶活HAT结构域的抑制作用[8]，从而激活p300的乙酰转移酶活性，而mTORCl的活性受到抑制时，p300的活性也显著下降[23]。在营养耗尽的条件下，p300依赖性乙酰化通过在K1097处的mTORC1组分Raptor的乙酰化来调节自噬[39]，Raptor的乙酰化使mTORC1与溶酶体膜上的Rag复合物相互作用，mTORC1在溶酶体膜上被激活，从而抑制自噬的发生。研究发现，mTORC1-p300通路在自噬启动和脂质生成中发挥着重要的作用，营养充足时，mTORC1磷酸化并激活p300，激活的p300乙酰化脂质合成的关键转录因子SREBP-1c，提高其转录活性，促进脂质生成；营养缺乏时，p300因mTORC1的失活发生脱磷酸化，活性受到抑制，LC3等自噬蛋白发生脱乙酰化而激活，自噬随之启动[23]。

Ac-CoA通过自噬核心机制中的蛋白乙酰化调节自噬，在HeLa、SH-SY5Y和HEK-293T细胞中，亮氨酸(leucine，Leu)通过其代谢产物Ac-CoA对mTORC1组分raptor的乙酰化影响自噬的发生，因此Leu-AcCoA-EP300通过mTORC1调节自噬[39]。p300/CBP siRNA下调PCAF通过激活磷脂酰肌醇3激酶复合物(phosphatidylinositol 3-kinase，P13K) /蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(protein kinase B，Akt/PKB)/mTOR信号通路抑制缺氧/复氧诱导的H9c2细胞自噬，从而减轻了细胞损伤[40]。凝血酶通过Akt途径诱导mTOR和p70S6K磷酸化，进而诱导p300磷酸化和p70S6K、p300、p65复合物形成，最终诱导人肺上皮细胞中核因子-κB活化和IL-8/CXCL8释放，在哮喘、慢性阻塞性肺疾病等肺部炎症性疾病中发挥着重要作用[41]。

2.2p300通过乙酰化自噬相关蛋白调节自噬自噬的起始除了需要激活ULKl复合物及其下游的III型P13K，还需要有Atgs介导，许多Atgs可以被翻译后修饰调控，如磷酸化、泛素化和乙酰化[42]。p300作为一种经典的HAT，在自噬的过程中通过调控Atgs的乙酰化状态来影响自噬的发生。Lee等[35]研究发现，在HEK293T和HeLa细胞中,沉默p300可以减少Atg5、Atg7、LC3和Atg12的乙酰化，增加其稳定性,激活自噬，p62水平降低；而过表达p300则产生相反的影响。越来越多的证据表明，自噬成分的乙酰化主要受乙酰转移酶p300和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依赖性脱乙酰基酶Sirt1调控，乙酰化/去乙酰化事件在自噬诱导中起关键作用。去乙酰化反应由Sirt1催化，其活性依赖于细胞NAD+的可用性，并受细胞代谢状态的影响[43]，Sirt1是III类赖氨酸组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)，能使ATG5、ATG7和LC3去乙酰化，并在几个步骤上正调控自噬[44]。在Sirt1缺失的情况下，饥饿诱导的自噬受损，Sirt1- /-小鼠出生时正常，但在出生后数小时到数天内死亡[45]。研究发现，HDAC1在肝细胞癌中过表达，抑制HDAC1诱导的自噬可抑制肿瘤细胞生长[46]。据报道，在阿尔茨海默病、癌症和衰老中，p300通过乙酰化Atgs来有效阻断自噬的发生[47-48]。长期接触苯与血液毒性以及再生障碍性贫血和白血病的发生有关，在慢性苯暴露患者分离的骨髓单个核细胞中，p300的活性降低，LC3和ATG7的乙酰化水平降低，自噬增加，在苯诱导的小鼠血液毒性模型中，苦瓜抗病毒蛋白30kd或氯喹通过提高p300的表达逆转了苯诱导的自噬和血液毒性[49]。说明通过抑制p300的药理学作用，降低Atgs的乙酰化水平，对不同的疾病模型有一定的治疗作用。

2.3p300通过乙酰化其直接靶点VPS34调节自噬Vps34是哺乳动物中唯一的III类PI3激酶，可磷酸化磷脂酰肌醇产生磷脂酰肌醇三磷酸，对于自噬的激活至关重要[50]。在自噬过程中，VPS34与吞噬泡的Beclin1、ATG14L和p150相互作用形成功能复合物[51]，活性受其调控蛋白Beclin1的相互作用控制。ULK1响应来自主要稳态传感器AMPK和mTORC1的信号刺激，磷酸化Beclin1，随后形成Beclin1-VPS34核心复合物，以激活VPS34[52]。VPS34是乙酰转移酶p300的直接作用靶点，它的活性可以被p300特异性乙酰化而抑制，影响隔离膜的生成从而抑制自噬的发生[23]。p300失活可引起VPS34去乙酰化而完全激活、3-磷酸磷脂酰肌醇的产生和部分自噬小体形成。质谱分析表明，乙酰化后的GST-VPS34有5个潜在的乙酰化位点，它们位于不同的结构域，K771位点的乙酰化直接降低了VPS34对其底物PI的亲和力，而K29位点的乙酰化阻碍了VPS34-Beclin1核心复合物的形成[10]。在HEK293细胞中检测到内源性的p300和VPS34的共同免疫沉淀复合物，而CTB增强了两者的表达[10]。p300-VPS34通路对典型和非典型自噬的启动至关重要，VPS34不仅在营养缺乏的情况下可以通过典型的AMPK-mTORC1-ULK1途径激活自噬启动，而且在上游调控激酶不受影响或缺失的情况下通过p300-VPS34通路也能激活自噬。在饥饿刺激小鼠肝脏自噬的模型中，p300失活，VPS34被激活，p300和VPS34的乙酰化程度降低，LC3斑点形成增加和选择性自噬接头蛋白 1(for the Lck SH2 domain of 62 kDa/ Sequestosome 1，p62)水平降低，CTB治疗阻止了饥饿诱导的VPS34去乙酰化和自噬，而C646单独治疗有效地触发了VPS34去乙酰化和自噬[10]。

3 结 语

目前的研究表明，乙酰转移酶p300作为转录激活因子，通过乙酰化H3参与转录的激活和乙酰化自噬相关蛋白来抑制自噬的发生，说明p300与自噬过程密切相关。然而，关于p300调控自噬仍有许多问题有待研究，如在H/R诱导的H9c2细胞损伤的模型中，下调p300/CBP可抑制自噬，是否有其他通路参与此模型中自噬的调节也需要进一步的研究。最近的研究表明，p300的抑制剂对多种疾病模型有一定的治疗作用，如肿瘤，衰老，神经系统疾病及炎症性疾病等。p300可能作为联系自噬与这些生物学功能的“纽带”，深入研究调控自噬产生的生物学作用，将为这些疾病的治疗提供新的药理学靶点。