母乳miRNA对婴儿生理功能发育的影响研究进展

王银妃，曾思洁，盛晓静综述，殷 勤审校

0 引 言

母乳(human breast milk，HBM)是婴儿出生后最佳的营养选择。母乳含有脂质、蛋白质、碳水化合物和矿物质，利于新生儿及婴儿消化和吸收，刺激和支持婴儿不成熟的免疫系统，为婴儿生长提供营养和能量[1]。世界卫生组织推荐在婴儿生后的6个月内进行纯母乳喂养，且继续母乳喂养直至2岁。

近年来，人们对母乳成分的研究越来越多，尤其是对其生物活性物质的研究，如微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)、人乳寡糖、乳铁蛋白等[2]。这些成分促进母乳喂养儿的免疫系统和胃肠道功能成熟，促进生长发育。配方奶以母乳为标准，添加乳铁蛋白、DHA、ARA等活性成分，以更接近母乳成分，得到了许多积极的发展结局，包括在认知功能，视力发育和免疫功能发育等的促进作用。然而配方奶不仅含有的miRNA数量不足，而且其miRNA与母乳的表达谱完全不同，这一缺陷可能对婴儿的长期免疫和代谢规划产生负面影响。母乳中大量miRNA的发现，使得越来越多的研究集中在母乳对婴儿健康的潜在作用上[3]。miRNA是许多生物学过程的关键调控因子。本文在简要描述miRNA的生物起源及其转运与吸收后，重点就母乳中miRNA对婴儿生理功能发育的影响做一综述。

1 miRNA的生物起源

微小核糖核酸是一类具有20～25个核苷酸的非编码小RNA，在信使RNA转录后发挥重要调控作用[4]。miRNA的生物发生是由核糖核酸聚合酶Ⅱ启动的，在细胞核合成，产生初级微小核糖核酸分子，然后由微处理器复合体加工成前微小核糖核酸分子，这些分子从细胞核中输出到细胞质中，被核糖核酸内切酶-Dicer酶进一步加工产生成熟的miRNAs。最终在RNA的沉默复合物的结合下，miRNA通过各种方式和机制如外泌体、微囊泡、核糖体复合物等转出细胞[4]。miRNA在不同的组织、细胞和生物液体中被发现，如血液、唾液、尿液、泪液和人类乳汁等。越来越多的研究报道母乳中含有丰富的miRNAs，已鉴定出约1400种不同的miRNAs，这些miRNAs可能对具有不同功能的基因进行调控，参与细胞和组织的分化、增殖和凋亡[5]。

2 母乳中miRNA的转运与吸收

miRNA须克服多种障碍来实现其功能，如胃肠道pH值、RNA酶、肠道菌群及肠细胞间的细胞连接。从消化道进入循环后，循环酶、免疫系统、血管内皮和膜本身对miRNA的完整性都有危害[6-7]。外泌体(exosomes)在miRNA的运输与吸收中起着关键作用。外泌体是约30 100纳米的双层脂质囊泡，由多种细胞产生，通过其内容物将信息传递给受体细胞[8]。此外，Charlotte等从人类母乳中分离出外泌体，并且证明它们包含小RNA分子以及参与细胞信号传导的膜和胞质蛋白质[9-10]。Liao等[11]人通过体外研究展示了母乳外泌体miRNAs在模拟胃/胰腺消化过程中的生存能力和复杂性。细胞通过多种内吞途径摄取外泌体，包括网格蛋白依赖型和网格蛋白不依赖型内吞途径。母乳外泌体保护miRNA免受降解，由内吞作用介导，依赖于外泌体表面糖蛋白，被肠道细胞摄取，然后进入血液循环，运送到各个器官[12]。

3 母乳miRNA对于婴儿生理功能发育的影响

人类母乳外泌体中的miRNAs可以通过多个方面来影响婴儿的生理功能发育。目前的研究主要集中于糖脂代谢、肠道、神经发育、免疫功能发育、表观遗传学和婴儿疾病防治等方面。

3.1母乳miRNA与糖代谢和脂代谢母乳作为婴儿期最重要的营养来源，是糖、脂代谢性疾病的保护因素[13]。母乳细胞外囊泡富含多种miRNAs，例如miR-148a、miR-92a、miR-146a、miR-125b、miR-26a、miR-33、miR-181b等，这些miRNAs对糖脂代谢有重要的调节作用[14]。在糖代谢方面，Melnik等[15]研究发现母乳来源的miRNA-148a与胰腺β细胞分化相关，由于胰腺β细胞分化与2型糖尿病的发生有密切的关系，因此，研究进一步发现母乳喂养对预防2型糖尿病的发生具有潜在的保护作用。miR-92a通过靶向KLF2可以抑制高糖环境诱导的细胞凋亡，增加胰岛素的分泌和增殖，从而在糖尿病中保护胰腺β细胞的功能，miR-92a可能成为临床中治疗糖尿病的潜在候选药物[16]。在脂代谢方面，miR-146a通过TGF-β和AKT/mTORC1信号通路，通过靶向SMAD4和TRAF6，从而抑制脂肪生成[17]。miR-125b-5p则可以通过抑制Map4k4，从而抑制动脉粥样硬化斑块的形成，降低脂代谢对于动脉粥样硬化的影响[18]。此外，相关文献报道，miR-26a、miR-33、miR-181b等miRNAs不仅影响糖代谢，同时也影响脂质代谢[19-21]。其中，miR-26a可以调节高脂肪饮食的小鼠肝中的葡萄糖和脂质代谢，肝miR-26a通过调节关键代谢基因参与葡萄糖代谢、脂质代谢和胰岛素信号[20]，miR-26a有可能成为治疗肥胖相关代谢综合征的潜在治疗靶点，有待于进一步的探索。miR-33*(miR-33a和miR-33b)位于甾醇调节元件结合蛋白基因内，是调节致脂基因表达的关键转录因子，miR-33b同时也可以抑制磷酸烯醇丙酮酸羧基酶和葡萄糖6-磷酸酶的表达，这是肝葡萄糖生成的2个关键酶，可以调节葡萄糖的生成[21]。另有发现miR-181b通过调节白色脂肪组织内皮功能改善血糖稳态和胰岛素敏感性，而miR-181b在HBM的EVs中含量丰富[19]。与配方奶喂养相比，母乳喂养可预防后期肥胖和2型糖尿病的发生。总之，HBM的miRNAs在糖脂代谢中具有潜在的重要作用，影响婴儿的代谢发育及成年期代谢性疾病的发生与发展。

3.2母乳miRNA与肠道发育母乳外泌体微小核糖核酸可能影响肠道的结构和功能，在新生儿、婴儿期，由于肠道结构和功能发育的不完全，这种影响尤为重要。肠道上皮细胞在营养物质的选择性吸收中起着基础性作用，此外肠道上皮细胞也是免疫调节细胞因子的主要来源和生理性上皮屏障的关键部分[22]。Martin等[23]在过氧化氢处理过的肠上皮细胞中，添加母乳外泌体消除了过氧化氢诱导的细胞死亡增加，同时显著提高了细胞活力，母乳外泌体可以保护肠上皮细胞免受氧化应激。母乳外泌体和肠上皮细胞之间存在相互作用，受到母乳miRNA调控[3]。MiR-200家族在母乳外泌体中含量丰富，可以影响上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，EMT在上皮结构中具有关键作用，miR-200和miR-375可增加细胞迁移和侵袭，miR-200b可在体外抑制肠上皮细胞紧密连接的中断[24]。miR-99b在母乳中含量非常丰富，可以增强乳脂肪球表皮生长因子Ⅷ的表达和恢复肠上皮细胞的迁移[25]。采用脂多糖建立的小鼠肠道炎症模型中，外泌体miR-4334和miR-219通过NF-κB途径减少脂多糖诱导的炎症，miR-338通过p53途径抑制脂多糖诱导的凋亡，而这些抗凋亡和抗炎作用是由外泌体miRNA介导的，miR-4334、miR-219、miR-338在母乳的外泌体中均富含[26]，婴儿可以通过母乳的摄入，实现外泌体miRNA转运影响肠道的结构和功能，促进肠道发育，同时减少新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)的发生。

3.3母乳miRNA与神经发育母乳外泌体中影响神经发育的含量高的miRNAs不多。最富含的miRNAs为let-7家族，因为let-7前体加工活性的增加与细胞的神经分化有关，有研究报道let-7在胚胎干细胞分化和神经发生的早期发育调控中起着一定的作用[27]。miR-29b也在母乳外泌体中被发现，小鼠miR-29b基因的敲除，会导致神经细胞的死亡[28]。在大鼠间充质干细胞中，miR-574-5p的过表达和下调分别促进和抑制神经发生[29]。在母乳中还检测到其他3种miRNAs(miR-15b，miR-132和miR-210)。作为let-7家族成员，miR-15b可以促进小鼠神经元的分化并抑制神经祖细胞的增殖[30]。miR-132则可以通过改善记忆，从而促进中枢神经系统的发育[31]。然而，miR-210的抑制则可以增加体外神经元存活[32]。总的来说，通过母乳外泌体miRNA的检测及其功能的研究，miRNA有益于早期神经功能的发育[33]，未来需要进一步研究更多的母乳外泌体中的miRNA，为促进婴儿神经系统的发展提供更多的理论基础。

3.4母乳miRNA与免疫功能发育母乳可以将与免疫相关的营养物质从母体传给婴儿。母乳不仅含有大量的免疫成分，还含有一些非特异性因子，如溶菌酶、乳铁蛋白、寡糖等。母乳中与免疫相关的miRNA包括miR-223，miR-146b-5p，miR-181a，miR-150，miR-155，miR-92a和miR-17等[34]。其中，miR-223、miR-146、miR-181a和miR-155在初乳中的表达量高于成熟乳，miR-181和miR-155则参与了B细胞的分化，在初乳中，这些表达量高的miRNA与新生儿母婴免疫能力的转移作用也是同步的[35]。miR-181a可以靶向IL1a mRNA的3′非翻译区，在体外调节单核细胞和巨噬细胞的炎症反应，从而提高其免疫功能[36]。miR-17和miR-92也存在于母乳中，与单核细胞发育的调节以及B和T细胞的分化和成熟有关[37]。婴儿的免疫功能影响着各种感染性疾病的转归与预后，Karam等[38]通过差异表达分析，发现血清miR-146a在脓毒症患儿组的表达水平低于健康儿童，并且和脓毒症的严重程度相关，这提示miR-146a对儿童脓毒症具有诊断和预后价值。miR-223则与免疫功能相关的粒细胞增殖有关[39]。Kohlhaas等[40]在小鼠miR-155基因缺失模型中发现胸腺和外周血中调节性T细胞数量减少，这表明这种miRNA可能对调节性T细胞的发育有着重要的影响。母乳喂养可能提高婴儿体内这些miRNA 的水平，从而起到抗感染、抗炎的作用。

3.5母乳miRNA与表观遗传调节母乳miRNA除了在婴儿糖脂代谢、肠道、神经、免疫等发育中起着一定的作用，还可以通过表观遗传机制，对个体的全生命周期产生一定的影响[12]。miRNAs可以通过调控DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的表达，参与DNA甲基化，这对各种基因的表达和人类疾病的发生与发展有着至关重要的作用[41]。miR-148a在母乳中含量丰富，能靶向DNMT1，从而分别增强叉状头/翅膀状螺旋转录因子、胰岛素、胰岛素样生长因子-1、脂肪含量和肥胖相关蛋白等发育基因的表达，来影响婴儿的生理功能发育。乳源性miR-125b可能抑制p53的转录网络，而p53和DNMT1都是控制转录和染色质结构的关键基因组，这些关键基因组可以影响全生命周期的发育与疾病发生发展[12]。

3.6母乳miRNA与婴儿疾病防治大量流行病学调查提示母乳能预防多种婴儿相关疾病的发生发展，如营养不良、支气管肺发育不良 (broncho-pulmonary dysplasia，BPD) 与NEC等，但具体作用机制目前仍有待研究[42-43]。而外泌体miRNA在治疗BPD、NEC、营养不良和过敏性疾病中也有良好的应用前景。

营养不良影响着全世界大约5000万儿童，与全球5岁以下儿童死亡率的45% 有关。严重急性营养不良与肠黏膜屏障破坏和上皮萎缩有关。在饲喂低蛋白饮食诱发营养不良的模型小鼠中，口服牛乳外泌体可以改善肠绒毛萎缩和屏障功能障碍。尽管持续低蛋白饮食喂养，外泌体治疗可改善肠道通透性、改善肠道结构和促进肠上皮细胞生长[44]。这些数据表明，对于发病率和死亡率高风险的营养不良儿童，外泌体可能作为一种辅助治疗手段。

在采用脂多糖建立的小鼠肠道炎症模型中，母乳外泌体中富含的miR-4334和miR-219可以通过NF-κB途径减少脂多糖诱导的炎症，miR-338通过p53途径抑制脂多糖诱导的凋亡[26]，提示母乳来源外泌体miRNA可作为降低新生儿 NEC 发生率和严重程度的治疗手段。

Braun等[45]通过间充质干细胞干预高氧诱导的BPD模型组新生大鼠，发现外泌体保护了高氧暴露下肺泡和血管的正常发育，而母乳外泌体中含有丰富的间充质干细胞。因此，母乳外泌体可能具有防治BPD的作用。

在一项回顾性研究中发现短期进行或不进行母乳喂养与儿童哮喘患病风险增高有关[46]。Rigotti 等[47]报道过敏母亲的乳汁中分泌的转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)较对照组明显减少。6个月后，46% 的过敏母亲喂养的婴儿出现特异性皮炎，而对照组未过敏母亲喂养的婴儿没有出现。TGF-β是 调节性T细胞分化的关键激活因子。而外泌体 miRNA-148a靶向 DNMT1和转移 TGF-β，可以增加胸腺 FOXP3稳定表达，从而促进调节性T细胞的发育[12,48]。 在纯母乳喂养期间，TGF-β 可能阻止特应性疾病的发展。因此，配方奶中缺失外泌体 TGF-β 和 miRNA-148a 信号，以及过敏母亲的母乳缺乏外泌体TGF-β，可能不利于调节性T细胞成熟，增加婴儿过敏风险。

3.7母乳miRNA的其他生理功能骨骼处于持续重塑的动态过程中，这有助于调节钙稳态，修复日常压力对骨骼造成的微小损伤，并在生长过程中塑造骨骼。在儿童早期，骨形成和骨重建都有发生。外泌体miRNA可与多种信号分子相互作用，调节成骨细胞和破骨细胞的活动，控制骨重建的过程[49-50]。

母乳中富含组织特异性的 miRNA，如脂肪组织特异性 miR-642、肝特异性miR-122、 心脏特异性的 miR-1 和 miR-133[34]。有学者猜想这些miRNA可能与婴儿心脏、肝等器官和组织发育及功能保护有关，有待于进一步研究证实。

4 结 语

综上所述，在国内外母乳喂养的好处已被广泛认可，母乳不仅是一种营养物质，更包含了促进婴儿生理功能发育的各种生物活性物质。母乳是婴儿早期生长发育不可替代的营养来源。虽然 miRNA在细胞与组织水平的作用已得到证实，但从宏观角度对机体的作用仍待进一步研究。未来需要更大样本的前瞻性队列研究，通过更为先进的实验室检验手段，来明确母乳外泌体中各种miRNAs对婴儿及全生命周期生长发育及疾病发生发展的影响，为精准阐明母乳在子代发展中的作用提供依据[51]。