离子色谱-电导法检测格瓦斯中痕量溴酸盐

邹沫君，吴 丽，王 正*

（乐山市食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000）

溴酸盐曾一度被烘焙业视为物美价廉的面团氧化剂而广泛应用于食品行业[1-2]，在面团的发酵、醒发及焙烤工艺过程中起到一种缓慢氧化的作用，使用后面粉更白，发酵速度更快，制作的面包更蓬松更漂亮，更具弹性与韧性，可达到优质小麦面粉的效果[3-4]。然而必须指出的是，1992年世界卫生组织确认溴酸盐是一种氧化性致癌物，长期食用会大大增加患肾癌、甲状腺和腹膜间皮瘤的发病率[5-6]，禁用为面粉处理剂，许多国家也停止使用[7]。我国卫生部于2009年发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第二批）》中明确规定，溴酸盐属于违法添加物质，食品生产加工企业在生产过程中不得使用溴酸盐生产食品[8]。

格瓦斯是一种盛行于俄罗斯、乌克兰及其他东欧国家的[9]，含低度酒精的饮料，采用俄罗斯大列巴面包干利用传统发酵工艺酿造而成，颜色近似啤酒而略呈红色，富含多种营养成分，如各种维生素、蛋白质、氨基酸、乳酸菌等[10-12]，不仅酸甜适度，清凉爽口，具有浓郁的面包味，口味极佳，而且能开胃、助消化、调节肠胃机能，具有增进机体新陈代谢，提高机体性能等保健功效[13-14]。随着消费需求的不断改变，格瓦斯作为一款营养健康的功能性饮品，受到我国许多消费者的喜爱，具有一定的市场潜力和发展空间[15]。

格瓦斯制作最主要的原料就是面包，可能会存在溴酸盐的潜在风险。近年来开发了饮用水和面粉中溴酸盐测定的多种仪器分析方法[16-18]，我国于2006年5月10日发布了GB/T20188—2006《小麦粉中溴酸盐的测定离子色谱法》[19]。由此可见，溴酸盐测定方法有多种，主要有气相色谱法[20-21]、高效液相色谱-串联质谱法[22-24]、离子色谱法（ion chromatography，IC）[25]、离子色谱-串联质谱法[26-27]和离子色谱-电感耦合等离子体质谱法[28]等。前两法均需对溴酸盐进行衍生后检测，较为繁琐；而离子色谱与质谱已越来越多地联用，其突出优点是检出限低，分析速度快，但是由于设备昂贵、操作复杂，使其在常规分析中的应用受到了限制，不属于常规设备，在基层单位很难推广应用。离子色谱法分析食品中的溴酸盐一直是研究的热点，具有快速、方便、选择性好、灵敏度高等特点，是近年来发展速度较快的分析方法之一[29]。目前，已广泛应用于食品、药物、环境、生物、农业、工业等各个方面[30]。

本研究探索建立了格瓦斯中溴酸盐的离子色谱-电导检测法，试样经石油醚洗去油脂，用超纯水振摇提取，依次过0.22 μm微孔滤膜、Dionex OnGuard II RP小柱及Dionex OnGuard II Ag/H小柱净化后，用阴离子交换色谱柱IonPac AS 19（250 mm×4 mm）分离，电导检测器检测，测定格瓦斯中溴酸盐的含量。旨在对格瓦斯中溴酸盐快速灵敏的检测提供参考，达到有效监控格瓦斯中溴酸盐含量的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

格瓦斯：市售；溴酸根（BrO3-）标准品（100 μg/mL）（编号GNM-SBRO3-002-2013）：国家有色金属及电子材料分析测试中心；石油醚（沸程30～60 ℃）、氢氧化钾（KOH）（均为分析纯）、甲醇（色谱纯）：天津市富宇精细化工有限公司；实验室用水为超纯水（电阻率为18.25 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

Thermo ScientificTMICS-1100离子色谱系统、Dionex OnGuard II RP小柱（2.5 mL）、Dionex OnGuard II Ag/H小柱（2.5 mL）、IonPac AS 19分离柱（250 mm×4 mm）、IonPac AG 19保护柱（50 mm×4 mm）：美国Thermo SCIENTIFIC公司；TGL-16台式高速冷冻离心机：四川蜀科仪器有限公司；DT-110X30水浴恒温振荡器：上海笃特科学仪器有限公司；STAR星系列超纯水机：上海砾鼎水处理设备有限公司；0.22 μm水系进口聚醚砜（polyethersulfone resin，PES）滤膜：美国颇尔公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

IonPac AS 19分离柱（250 mm×4 mm）、IonPac AG 19保护柱（50 mm×4 mm）；淋洗液源：带有连续-再生阴离子捕获柱（continuously regenerated anion trap column，CR-ATC）的洗脱液发生器（eluent generator cartridge，EGC）II KOH；梯度淋洗条件：0～12.0 min，8 mmol/L KOH；12.1～18.0 min，45 mmol/LKOH；18.1～23.0 min，8 mmol/LKOH；检测器：电导检测；抑制器：ASRS ULTRA II 4 mm，自循环电抑制，电流89 mA；流速：1.0 mL/mm；柱温：30 ℃；定量环：500 μL。

1.3.2 标准溶液的配制

准确移取一定量的溴酸根（BrO3-）标准品，用水逐级稀释成质量浓度分别为1.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、25.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L的标准工作溶液。在1.3.1色谱条件下进行测定，以溴酸根（BrO3-）质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制溴酸根BrO3-峰面积-质量浓度标准曲线。

1.3.3 试样制备

试样提取：准确称取2.5 g（精确至0.01g）试样于100 mL具塞三角瓶中。加入20 mL石油醚洗去油脂，倾去石油醚，在50 ℃条件下干燥。加入50 mL超纯水，迅速摇匀置振荡器上振摇20 min，取下，静置，转入离心管中，10 000 r/min转速下离心10 min，取上清液备用。

试样净化：取上述备用上清液依次通过0.22 μm水系进口聚醚砜PES滤膜、Dionex OnGuard II RP小柱和Dionex OnGuard II Ag/H小柱，弃去前10 mL流出液，收集其后流出液直接进行色谱分析。Dionex OnGuard II RP小柱使用前用5 mL甲醇和10 mL纯水活化，Dionex OnGuard II Ag/H小柱用20 mL纯水活化，均放置20 min备用。

2 结果与分析

2.1 试样前处理条件的选择

格瓦斯是用面包干发酵酿造而成，但需要使用传统的俄罗斯大列巴面包，在该面包的整个工艺配方中加盐而不加糖，利用面包中的淀粉水解转化成葡萄糖，类似于传统的糯米酒酿，富含多种有机物质，其中不乏大分子物质。若试样不经适当前处理程序，连续多次色谱分析后，此类大分子物质因与色谱柱基质间较强的亲和作用，被吸附在柱内，不易洗脱，将导致柱效急剧下降。本试验选用石油醚洗去油脂，水浴振摇提取法提高溴酸根（BrO3-）提取率，依次通过0.22 μm水系滤膜、Dionex OnGuard II RP小柱，利用共价吸附作用，捕获残余的大分子有机物，减少对色谱柱的污染。再经Dionex OnGuard II Ag/H小柱除去试样提取液中Cl-，降低对溴酸根（BrO3-）测定的干扰，防止高浓度Cl-导致色谱柱过载。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择

格瓦斯中常含有多种营养成分，因此在测定其中溴酸盐时，需要选用柱容量较高的分析柱。IonPac AS 19离子色谱柱专为测定痕量溴酸盐（一种臭氧消毒的毒副产物）设计，高柱容量和选择性有助于测定μg/L质量浓度水平的溴酸盐；该色谱柱是Dionex在聚合物键合技术方面的新进展，用高容量树脂（60.240 ueq/column，4 mm）优化了柱子对溴酸盐的选择性，确保在使用抑制性电导检测的情况下，即使存在超高浓度的氯化物、硫酸盐和碳酸盐，也能通过使用KOH梯度实现对低浓度溴酸盐的定量测定。同时，这种聚合物亲水性非常好，对KOH淋洗液选择性很好，可以使用较低浓度的淋洗液。因此选用IonPac AS19作为分析住。

2.2.2 淋洗液系统选择

CO32-型和OH-型是离子色谱分析阴离子常用的两种淋洗液。其中，在色谱分析中应用范围最广的为CO32-型，但因其经抑制器转化后为碳酸，碳酸部分电离出碳酸根离子与氢离子，导致背景电导较高，水负峰较大，灵敏度降低，需要对试样进行浓缩等前处理，不适合大体积直接进样与梯度淋洗。然而，OH-型淋洗液克服了上述不足，在线产生系统电解水生成高纯KOH，经抑制器转化为水，没有碳酸盐污染，具有较小的水负峰与较高的灵敏度，可以得到较好的保留时间重现性与较低检出限。因此，选择OH-型体系。

2.2.3 淋洗液浓度选择

格瓦斯为面包汁发酵酿造，其制品中往往存在大量无机阴离子和有机酸。淋洗液浓度的选择关系到待测组分BrO3-与试样中无机阴离子及有机酸的分离效果评价与出峰时间的确定。由于BrO3-属于亲水性阴离子，在分析柱上保留相对较弱，因此一般情况下需要浓度较低的淋洗液进行梯度淋洗，从而得到良好分离效果。经过试验摸索，综合考虑试样分离度和分析时间，本试验最终选择了8 mmol/L KOH作为初始浓度进行淋洗，待BrO3-出峰后，再使用高浓度45 mmol/L KOH淋洗液冲洗6 min分析柱，将吸附在柱上的强保留性物质（疏水性阴离子）洗脱下来，然后经平衡回到起始浓度。因此选用KOH梯度淋洗作为试验条件，实现溴酸盐的准确定量。

2.2.4 流速和柱温耐受性考察

分别考察采用不同流速及柱温进行测定时色谱行为的变化，见表1。以溴酸盐质量浓度计，不同流速条件下相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值为0.51%，不同柱温条件下RSD值为0.53%。由表1可知，在实际检测过程中色谱条件（流速及柱温）有微小变化时，溴酸盐含量测定条件较宽，结果基本不受影响，系统具有较好的耐受性。因此，流速可选0.9～1.1 mL/min、柱温可选29～31 ℃。

表1 系统耐受性试验考察结果Table 1 Results of systematic tolerance test

2.3 色谱行为

经试验探索，综合考虑溴酸盐保留时间及峰分离度等因素，最终选用1.3.1项色谱条件，实现了格瓦斯试样中溴酸盐的准确定量。溴酸盐标准溶液、阴性试样溶液以及阴性加标试样溶液色谱图见图1。由图1可知，该方法选择性高，分离效果好，加标试样出峰良好。

图1 溴酸盐标准溶液（A）、阴性试样（B）及阴性加标试样（C）离子色谱图Fig.1 Ion chromatogram of bromate standard solution (A),negative sample (B) and negative spiked sample (C)

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系、方法检出限和定量限

取溴酸盐系列标准工作溶液，按1.3.1中色谱条件进样，以溴酸盐峰面积对质量浓度计算线性回归方程，确定相关系数。比较溴酸盐色谱信号峰与基线信号，确定仪器最低检出限（S/N=3），按试样制备过程，得出方法检出限与定量限，结果见表2。由表2 可知，溴酸盐在1.0～100.0 μg/L范围内线性关系良好（R2=0.9998），且该方法检出限为0.048μg/g，定量限为0.16 μg/g，能完全满足分析检测要求。

表2 溴酸盐的回归方程、相关系数、检出限及定量限Table 2 Regression equation,correlation coefficient,limit of detection and quantitation of bromate

2.4.2 精密度试验

取50.0 μg/L溴酸盐标准溶液，在上述条件下重复进样6次，计算精密度试验结果RSD，结果见表3。

表3 精密度试验结果Table 3 Results of precision tests

由表3可知，溴酸盐的保留时间和峰面积检测结果的RSD分别为0.21%和0.44%。结果表明该检测方法精密度良好。

2.4.3 稳定性试验

取制备好的格瓦斯供试品溶液，按“1.3.1”项色谱条件每间隔4 h进样1次，测定溴酸盐质量浓度，结果见表4。

表4 稳定性试验结果Table 4 Results of stability tests

由表4可知，稳定性试验结果RSD为0.49%，表明该检测方法稳定性良好。

2.4.4 回收率试验

分别精密称取3份格瓦斯试样，加入低（2.5 μg/L）、中（5.0 μg/L）、高（25.0 μg/L）3种质量浓度的溴酸盐标准溶液。按上述方法提取、净化后，进行色谱分析，对每个添加水平做3次平行试验，计算各组分的平均回收率及其RSD，以考察方法的准确性，结果见表5。由表5可知，溴酸盐的平均回收率在93.08%～98.05%范围内，RSD为0.85%～1.16%。结果表明，该检测方法准确度良好，符合分析检测要求。

表5 加标回收率试验结果Table 5 Results of standard recovery rate tests

2.5 实际试样分析

利用本试验所建立的方法，对市面上几款格瓦斯饮品中痕量的溴酸盐进行测定，结果见表6。由表6可知，该方法对这些试样均具有良好的适用性，色谱无干扰，不同品牌格瓦斯中溴酸盐本底含量存在一定的差异。

表6 格瓦斯试样中溴酸盐含量分析结果Table 6 Analysis results of bromate content in Kvass samples

3 结论

本实验建立了离子色谱法测定格瓦斯中痕量溴酸盐的方法：试样经水浴振摇提取，采用固相萃取小柱净化，以IonPac AS19阴离子交换色谱柱（250 mm×4 mm）分离，8～45 mmol/L KOH溶液梯度淋洗，抑制性电导检测。该方法分离效果良好，操作简便，灵敏度高，精密度、准确度及稳定性均能满足实际检测工作要求，值得推广应用。