原发肺黏液表皮样癌活检、冷冻与常规病理特征的对比分析及MAML2基因重排的意义

秦积龙，魏建国，刘海平，姚小飞，林晓东，范 蕾，何 萍

黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma, MEC)是最常见的涎腺恶性肿瘤，占涎腺恶性肿瘤的30%～35%[1]，但原发肺黏液表皮样癌(pulmonary mucoepidermoid carcinoma, PMEC)较少见，不足肺恶性肿瘤的1%[2]。在临床工作中，尤其是小活检及术中快速冷冻病理诊断中PMEC易与肺腺癌及腺鳞癌混淆。本文重点探讨PMEC活检、冷冻与常规切片的病理特征及MAML2基因重排情况，以提高活检及术中快速冷冻诊断PMEC的准确性，并深入分析MAML2基因重排与PMEC临床病理学特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集2018年1月～2021年4月广州医科大学附属第一医院病理科存档的51例PMEC标本。其中手术根治标本43例，穿刺活检标本8例。由两名高年资病理医师采用双盲法阅片，51例诊断结果一致，且患者既往无涎腺肿瘤病史，涎腺影像学检查亦未发现肿瘤。收集患者的临床病理资料包括性别、年龄、肿瘤部位、临床表现、临床分期及病理学特征，并进行电话随访。

1.2 方法冷冻及常规切片行HE染色，镜下观察。所用一抗CKpan、TTF-1、Napsin A、CK7、CK5/6、Ventana ALK(D5F3)、EMA、CEA、p40、p63、Ki-67及S-100，均购自福州迈新公司。免疫组化检测均在全自动免疫组化染色仪上进行。黏液卡红染色步骤严格按试剂盒说明书进行。FISH检测MAML2基因分离情况(DNA分离探针，购自安必平公司)。采用电话进行随访。

1.3 结果判断采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，采用χ2检验进行组间比较，采用Kaplan-Meier曲线和Cox单因素回归模型进行生存分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征51例PMEC中男性38例，女性13例，男女比为2.9 ∶1。年龄8～81岁，中位年龄50岁。中央型32例，年龄8～74岁，中位年龄42岁；周围型19例，年龄36～81岁，中位年龄63岁。病变位于右上肺15例，右中肺4例，右下肺10例，左上肺10例，左下肺12例。28例行活检，其中纤维支气管镜活检20例，穿刺活检8例。43例行肺叶切除术后均行淋巴结清扫，17例发生淋巴结转移，其中20例行术前活检，23例行术中冷冻病理诊断。33例临床表现为咳嗽、咳痰(33/51)，6例伴咯血，6例伴胸痛、胸闷。18例无明显症状，体检时偶然发现。影像学特征：中央型多位于叶或段支气管腔内，与支气管关系密切，病灶大多欠均匀，低中等密度，增强后显示明显不均匀强化，常合并肺炎或肺不张，PET放射性摄取轻中度增高(图1A)，拟考虑为鳞状细胞癌或涎腺源性肿瘤：MEC。周围型多表现为肺内孤立性肿块，肿瘤境界相对清楚，PET放射性摄取明显增高，拟考虑为周围型肺癌(图1B)。临床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期7例，Ⅲ期10例，Ⅳ期7例。51例患者中，单纯手术治疗33例，手术+化疗8例，手术+靶向治疗1例，手术+化疗+免疫治疗1例；8例经穿刺活检确诊，未行手术治疗，其中化疗+免疫治疗4例，单纯化疗1例，靶向治疗1例，2例放弃治疗。

图1 A.中央型：CT示肿物位于支气管腔内，病灶欠均匀，低中等密度，增强后显示明显不均匀强化，PET放射性摄取轻中度增高；B.周围型：CT示肺内孤立性肿块，肿瘤境界相对清楚，PET放射性摄取明显增高

2.2 病理检查

2.2.1眼观 肿瘤最大径0.7～8.0 cm，平均3.2 cm，无包膜，切面灰白色，有黏液感。中央型中18例位于支气管腔内，呈息肉样突向管腔。周围型肿物紧邻胸膜，边界清楚。

2.2.2镜检 28例行活检，21例诊断为PMEC(21/28，75%)，3例诊断为肺鳞状细胞癌(图2)，2例诊断为肺腺癌，1例诊断为肺腺鳞癌，1例诊断为肺混合性鳞状细胞和腺性乳头状瘤。23例行术中冷冻病理检查，8例诊断为PEMC(8/23，35%)，11例诊断为腺鳞癌，3例诊断为腺癌(图3)，1例诊断为鳞状细胞癌。低级别PMEC镜下见大小不等的囊状及腺样结构，肿瘤细胞异型性不明显，未见明显核分裂象及坏死，无腺癌的腺泡状结构及贴壁生长方式，而表皮样细胞未见角化及细胞间桥。其中2例出现囊性变，间质胆固醇结晶形成，大量淋巴细胞及浆细胞浸润(图4)，在冷冻切片诊断时极易误诊为支气管扩张症或间质性肺炎。高级别PMEC镜下见肿瘤组织呈实性片状及岛状排列，很少出现囊状结构，由不典型多角形表皮样细胞及中间细胞构成，可见坏死，间质淋巴细胞及浆细胞浸润。其中3例肿瘤呈实性巢、团状排列，核空泡状，核仁明显，间质大量淋巴细胞及浆细胞浸润(图5)，在冷冻切片诊断时极易误诊为淋巴上皮癌。在常规石蜡切片中间质出现纤维化及硬化，8例伴钙化，6例伴黏液变性，40例(40/51，78.4%)间质见大量淋巴浆细胞浸润，形成肿瘤相关淋巴增生(tumour associated lymphoid proliferation, TALP)，其中23例发生在低级别，17例发生在高级别，3例伴有淋巴滤泡形成。经广泛取材在高级别PMEC实性片状肿瘤周边可见低级别PMEC的囊状及腺样结构。病理学分级：26例(26/51，51%)为低级别，25例(25/51，49%)为高级别。中央型组以低级别为主，周围型组以高级别为主。17例淋巴结转移病例，病理学级别均为高级别。

图2 纤维支气管镜活检见肿瘤细胞呈实性巢团状排列 图3 冷冻切片镜下见肿瘤细胞呈腺样排列，细胞有异型性 图4 低级别肺黏液表皮样癌：囊状扩张的肿瘤间质见大量淋巴细胞、浆细胞浸润，胆固醇结晶形成 图5 高级别肺黏液表皮样癌：瘤细胞呈实性片状生长，核空泡状，可见明显核仁，间质大量淋巴细胞、浆细胞浸润 图6 肿瘤细胞弥漫表达Ventana ALK(D5F3)，Mutimer法 图7 FISH检测MAML2分离探针示红绿信号分离

2.3 免疫表型及特殊染色所有肿瘤细胞包括黏液细胞、表皮样细胞及中间细胞均弥漫表达CKpan、CK7，表皮样细胞及中间细胞表达p40、p63及CK5/6。黏液细胞表达CK7、CEA、EMA，不表达TTF-1、Napsin A及S-100。其中1例肿瘤细胞弥漫表达ALK(图6)，二代测序显示EML4-ALK基因融合。低级别PMEC的Ki-67增殖指数低于10%，高级别PMEC的Ki-67增殖指数40%～90%。特殊染色黏液卡红示黏液细胞腔内黏液样物阳性。

2.4 FISH检测PMEC中35例(35/51)MAML2基因重排阳性(图7)，总阳性率为68.6%，16例MAML2基因重排阴性。MAML2基因重排阳性的患者更常见于病理学分级为低级别[低级别84.6%(22/26)vs高级别52.0%(13/25)]、临床分期早的PMEC[Ⅰ～Ⅱ期85.2%(29/34)vsⅢ～Ⅳ期35.2%(6/17)]及淋巴结无转移的PMEC[无转移88.2%(30/34)vs有转移29.4%(5/17)](P<0.05)。MAML2基因重排与患者性别、年龄、病变部位及肿瘤大小无相关性(P>0.05，表1)。

表1 MAML2基因重排与原发肺黏液表皮样癌临床病理特征的关系

2.5 随访本组51例PMEC患者有5例失访，46例获得随访，随访时间4～42个月，平均随访时间19个月。4例患者死亡(7～12个月)，临床分期均为Ⅲ～Ⅳ期，均发生淋巴结转移，2例行单纯手术治疗，1例行化疗+免疫治疗，1例行单纯化疗。死亡病例MAML2基因重排检测均阴性；2例复发，复发病例MAML2基因重排检测均阴性；12例带瘤生存；28例无瘤生存，无瘤生存患者MAML2基因重排检测均阳性。1例ALK基因融合阳性患者，MAML2重排阴性，伴有淋巴结及肝、脑转移，经手术根治及靶向药物ALK抑制剂克唑替尼治疗，随访18个月患者状况良好。

2.6 生存分析单因素分析显示患者总生存期延长与临床分期早(P=0.000 7，图8A)、病理学分级为低级别(P=0.025 4，图8B)、MAML2基因重排阳性(P=0.001 9，图8C)及手术+辅助治疗/全身治疗(P=0.025 4)(图8D)均相关(P均<0.05)，而与患者年龄、部位、肿瘤体积大小均无相关性(P>0.05)。

图8 Kaplan-Meier曲线分析预后相关因素：A.临床分期与患者预后的关系；B.病理学分级与患者预后的关系；C.MAML2基因重排与患者预后的关系；D.治疗方式与患者预后的关系

3 讨论

PMEC是肺原发涎腺型肿瘤中最常见的病理类型。诊断PMEC之前首先要排除涎腺MEC肺转移，主要依靠临床无涎腺肿瘤病史，涎腺影像学检查未发现肿瘤。PMEC发病年龄较广泛，研究显示无明显性别差异[3-4]。临床症状无特异性，主要表现为咳嗽、咳痰伴胸痛、胸闷，部分患者无明显症状，因健康体检时偶然发现，与本组情况基本相符。

术前活检因取材量少且表浅，明确诊断常有挑战性。这也是本组28例活检病例中，7例诊断为其它肿瘤类型的原因。术中冷冻诊断是常用的检查手段。对于PMEC的冷冻诊断，需要病理医师充分了解PMEC的临床病理特点，才能做出明确诊断。若病变不典型，医师又缺乏对PMEC的认识，易误诊或存在诊断上的困惑。本组23例行术中冷冻病理检查，8例诊断为PEMC，15例诊断为其它类型肺恶性肿瘤。作者分析冷冻切片误诊的主要原因有以下三点：(1)病理医师只关注切片的镜下形态学特征，忽略了患者的临床影像学特征，对于年龄小于40岁，特别是位于气管或支气管等大气道部位的肺肿瘤患者，对于组织形态并非典型的鳞状细胞癌或腺癌患者，病理医师一定考虑到肺涎腺肿瘤的可能性。(2)PMEC形态复杂多样，回顾23例冷冻病理切片的形态学特征，其中21例肿瘤呈实性片状生长，周边出现腺样及囊状结构，瘤细胞核深染，异型性明显，部分可见坏死。(3)冷冻切片较厚，组织结构易扭曲、变形，细胞出现异常增大或变小，HE染色没有常规病理切片清晰，且通常因取材受限，存在取材不充分，有时未取到典型病变，给冷冻病理诊断带来一定的困难；再者诊断医师对PEMC认识不足，镜下发现腺样结构就首先考虑肺腺癌。需要强调的是：低级别PMEC与支气管关系密切，三种成分混杂，异型性小；而支持高级别的线索包括：有低级别向高级别过渡的区域、无原位鳞状细胞癌或原位腺癌的区域、无乳头状生长模式、无单个细胞角化或角化株形成等。总之活检或冷冻病理诊断由于取材受限且无免疫组化的辅助，故应仔细寻找PMEC的典型病理学模式。

据文献报道[4]低级别PMEC占73%～80%，高级别占19%～26%。本组中低级别26例(26/51，51%)，高级别25例(25/51，49%)，与文献报道的以低级别为主略不一致，可能与样本的选择偏倚有关。中央型PMEC以低级别为主，周围型以高级别为主。Yousem等[5]报道的45例低级别PMEC中16例(16/45，36%)出现TALP。Shilo等[6]报道的44例低级别PMEC中6例(6/44，13.6%)出现TALP，6例均显示较多且弥漫的淋巴浆细胞浸润，涉及至少60%的肿瘤并将其分成上皮岛，认为识别这种组织学变异对PMEC的诊断非常重要。本组40例(40/51，78.4%)肿瘤间质出现TALP，其中23例发生在低级别，17例发生在高级别，3例伴有淋巴滤泡形成。当TALP非常明显且浸润上皮时，易误诊为肺黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤。本实验也证实了出现TALP是PMEC重要的诊断线索。

本组1例69岁女性患者，肿瘤细胞弥漫表达ALK，二代测序显示EML4-ALK基因融合，临床分期为Ⅳ期，伴有淋巴结及肝、脑转移，经手术根治后及靶向药物ALK抑制剂克唑替尼治疗，取得了较好的疗效，随访18个月患者状况良好。Onodera等[7]报道1例35岁女性PMEC患者，临床分期为Ⅲ期，伴有淋巴结转移，出现EML4-ALK基因融合，术后放化疗联合ALK抑制剂艾乐替尼治疗取得了较好的疗效。本实验与文献报道一致，即ALK阳性PMEC经ALK抑制剂靶向治疗后取得较好疗效。

大多数MEC中存在t(11；19)(q21；p13)染色体易位，产生CRTC1(CREB regulated transcription coactivator 1)-MAML2(Master mind-like gene 2)基因融合[8]。约5%的MEC存在t(11; 15)(q21; q26)易位导致CRTC3-MAML2基因融合[9]。MAML2重排可作为确诊MEC非常实用的分子标志物[10-11]。Achcar等[12]的研究结果显示PMEC中MAML2重排阳性率为77%，张欣等[13]报道MAML2重排阳性率为80.4%(低级别组为91.7%，高级别组为40%)。本组中，MAML2重排总阳性率为68.6%(低级别组为84.6%，高级别组为52.0%)，高级别PMEC中MAML2重排阳性率显著低于低级别，与文献报道一致。Miyabe等[14]的研究结果证实MAML2重排与惰性的生物学行为及良好预后相关，且MAML2重排与较低的淋巴结和远处转移相关。本组资料显示，MAML2基因重排阳性更常见于病理学为低级别、临床分期早(Ⅰ～Ⅱ期)及淋巴结无转移的患者。本组中，5例死亡病例及2例复发病例病理学分级均为高级别，均发生淋巴结转移且MAML2基因重排阴性。28例无瘤生存病例MAML2重排均阳性。故进一步证实了MAML2重排为预后好的指标。研究表明MAML2重排可预测无瘤生存和疾病特异性生存，MAML2重排与更长的生存期显著相关。张欣等[13]对43例原发性PMEC患者进行生存分析，显示发病年龄≤40岁、肿瘤体积小、病理学分级为低级别、临床分期早、有MAML2基因重排、确诊时肿瘤无转移及手术治疗均与患者总生存期延长显著相关。本组单因素分析显示，PMEC患者总生存期延长与临床分期早、病理学分级为低级别、MAML2重排阳性及手术+辅助治疗均相关。因此可见，临床分期晚、病理学分级为高级别的PMEC预后较差，手术+辅助治疗可显著延长生存期。目前PMEC尚无统一的治疗标准，早发现、早诊断，并积极给予手术切除+淋巴结清扫，对患者的长期预后有积极作用。本组中8例经穿刺确诊，因患者拒绝手术，未行手术治疗，其中2例死亡，2例复发，1例带瘤生存，3例失访。

综上所述，PMEC的活检及术中冷冻切片诊断困难，常误诊为肺鳞状细胞癌、肺腺癌或肺腺鳞癌，TALP对PMEC的诊断具有重要提示作用。MAML2基因重排与低级别、临床分期早及淋巴结无转移相关，提示是预后好的指标。患者的预后好的因素包括临床分期早、病理学分级为低级别、MAML2基因重排阳性及手术+辅助治疗/全身治疗。